Méthodes pour le pH intracellulaire d’imagerie de la lignée de cellules souches de follicule en Live drosophile de tissu ovarien

Summary

Nous fournissons un protocole d’imagerie pH intracellulaire d’une lignée de cellules souches épithéliales en direct tissus ovariens de drosophile . Nous décrivons des méthodes pour générer des mouches transgéniques exprimant un biocapteur de pH, le mCherry::pHluorin, l’image le biocapteur utilisant l’imagerie par fluorescence quantitatives, générer des courbes standard et convertir les valeurs d’intensité de fluorescence aux valeurs de pH.

Abstract

Variations de pH intracellulaire (pHi) jouent un rôle important dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires, y compris le métabolisme, la prolifération et la différenciation. En général, pHi dynamique est déterminée dans des cellules cultivées, qui sont prêtent bien à mesurer et manipuler expérimentalement pHi. Cependant, le développement récent de nouveaux outils et de méthodologies a permis d’étudier pHi dynamique au sein de tissus intacts, vivre. Pour la recherche de la drosophile , une évolution importante a été la génération d’une lignée transgénique portant un biocapteur pHi, mCherry::pHluorin. Nous décrivons ici un protocole que nous utilisons régulièrement pour imagerie live Drosophila ovarioles pour mesurer pHi dans la lignée de cellules souches (FSC) épithéliales folliculaires dans mCherry::pHluorin transgénique de type sauvage lignes ; Cependant, les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptés pour les autres tissus, y compris les disques alaires et l’épithélium de le œil. Nous décrivons les techniques pour exprimer des mCherry::pHluorin dans la lignée de la FSC, maintien des tissus ovariens pendant direct imaging, acquisition et analyse d’images pour obtenir les valeurs de pHi.

Introduction

Études récentes ont révélé un rôle pour les modifications du pHi pendant cellulaire différenciation et dysplasie en vivo^1,2. Ces études ont montré que pHi est remarquablement constant dans les cellules du même type au même stade de différenciation, mais qu’il change à mesure que les cellules de transition d’un stade à l’autre. Dans certains cas, bloquant les changements pHi partiellement perturbe la différenciation, ce qui suggère que le changement du pHi n’est pas simplement une conséquence des changements dans le sort de la cellule mais contribue plutôt à promouvoir le changement dans le destin cellulaire, peut-être par le biais des effets sur la régulation pH sensibles les protéines ou les réactions chimiques nécessaires à la différenciation. Les études à venir sont susceptibles de révéler plus de perspicacité dans les nombreux différents rôles de pHi dynamics in vivo. Toutefois, l’un des défis d’étudier le pHi au cours de la différenciation in vivo est d’obtenir des mesures précises de pHi. Contrairement à d’autres caractéristiques de différenciation, comme les changements dans la morphologie cellulaire et l’expression des gènes, pHi est une propriété chimique labile de la cellule qui n’est pas conservée dans les cellules qui ont été fixés et perméabilisées avec des méthodes standard. En outre, pHi peut-être pas stable dans les cellules qui sont stressés ou de mourir à la suite de la manipulation expérimentale. Ainsi, il est important de garder les cellules vivant et en bonne santé que possible lors de la mesure de pHi. Plusieurs colorants vitaux sont disponibles que fonctionnent bien pour mesurer le pHi de cellules en culture³, mais dans de nombreux cas, ils ne sont pas appropriées pour in vivo études parce qu’ils ne pénètrent pas le tissu profondément ou uniformément assez pour fournir des mesures précises .

Pour contourner le problème de la pénétration du colorant pauvres, nous et autres avons utilisé une sonde génétiquement encodée, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, qui peut être exprimé plus précisément dans la cellule types d’intérêt et imagés dans des tissus vivants. pHluorin est une variante de GFP avec un pKa plus élevé (~ 7.0 vs ~ 4.0) qui se plie plus facilement à des pH plus élevés ; Si l’intensité de fluorescence totale émise par une population de pHluorin molécules dans la cellule augmente avec le pHi⁸. Ce qui est important, la fluorescence est linéaire dans la plage normale cytosolique des valeurs de pHi. En revanche, la fluorescence de la mCherry (pKa ~ 4,5) est insensible aux variations de pH comprise entre cytosolique. Ces deux journalistes sont liées de façon covalente ensemble comme une seule protéine chimérique, codée par un cadre de lecture unique, donc ils sont toujours présents en quantités égales. Par conséquent, le ratio de pHluorin à l’intensité de la fluorescence mCherry fournit une mesure de pHi qui est normalisée à la concentration de sonde dans chaque cellule. Les ratios peuvent ensuite être convertis aux estimations des valeurs de pHi à l’aide d’une courbe d’étalonnage qui est générée en obtenant la pHluorin mCherry ratios de tissus qui ont été équilibrés à des valeurs de pH connus.

Nous décrivons ici les méthodes pour l’utilisation de mCherry::pHluorin pour mesurer le pHi de la lignée épithéliale de FSC dans l’ovaire de la drosophile . Ce tissu bien caractérisé a été utilisé pour modéliser les nombreux aspects de la biologie épithéliale, tels que les cellules souches autorenouvellement et différenciation^9,10,11, migration des cellules collectives¹² , le développement et la maintenance de la cellule polarité^13,14. L’épithélium folliculaire est produit par deux sociétés qui résident au bord antérieur du tissu dans une structure appelée le germarium^15,16. Ces cellules se divisent régulièrement au cours de l’âge adulte pour se renouveler et de produire des descendants, appelées cellules prefollicle (PFC), qui peuvent rentrer dans la niche et devenir une FSC ou se différencient en un des trois types de cellules différents follicule : cellules polaires, des cellules de tige, ou cellules de l’organisme principal de follicule. Nous avons démontré précédemment que dans les tissus de type sauvage, le pHi augmente progressivement durant les premiers stades de différenciation, d’un pHi environ 6.8 en FSC à 7,0 dans HPF, 7.3 en follicule cellules². Bloquer cette augmentation par ARNi précipitation d’un échangeur de sodium/proton ubiquitaire expresse, DNhe2, altère la différenciation pFC gravement, mais bien que pHi a augmenté la surexpression des DNhe2 entraîne une différenciation excès douce phénotype. Ces résultats démontrent que le pHi est solidement maintenu dans la lignée FSC au début et qu’il peut être expérimentalement augmente ou diminue en vivo. Les méthodes décrites ici peuvent servir à mesurer les pHi en tissu de type sauvage ou diverses formes de tissus mutants, y compris les Arni knockdown ou surexpression utilisant un Gal4 d’intérêt et des clones mitotiques.

Protocol

Remarque : pour mesurer pHi dans la lignée de la FSC, nous calculer le rapport des intensités de fluorescence de pHluorin à mCherry en FSC, les PFC et les cellules folliculaires dans les conditions physiologiques et convertir les rapports en valeurs de pHi à la norme courbes d’étalonnage pour chaque cellule de type 7. Tout d’abord, vivre des expériences d’imagerie sont réalisées pour mesurer les intensités de fluorescence des pHluorin et des mCherry en germaria disséqué dans un…

Representative Results

Ici, nous avons décrit le processus de mesure pHi dans l’épithélium folliculaire, qui implique plusieurs étapes. Tout d’abord, les ovaires sont disséqués de mouches du génotype approprié à l’aide des outils de dissection et de fixation (Figure 1). Les ovarioles sont imagés puis à l’aide de la microscopie en fluorescence quantitatives et les images sont analysés pour obtenir des mesures de pHi. Pour chaque image, les types de cellules d’i…

Discussion

Nous décrivons ici une méthode de mesure du pHi des cellules de la lignée FSC dans le tissu de type sauvage. Ce protocole a été développé et affiné au cours des cinq dernières années, puisque nous avons commencé à étudier pHi dans drosophile tissu ovarien. Pendant ce temps, le protocole a été utilisé avec succès par plusieurs chercheurs dans notre laboratoire et au moins quatre disques de rotation différents et les microscopes à balayage laser. La reproductibilité de notre observation origina…

Materials

Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3