Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Summary

Forniamo un protocollo per l’imaging di pH intracellulare di una stirpe delle cellule staminali epiteliali in vivo tessuto ovarico di Drosophila . Descriviamo i metodi per generare mosche transgenici che esprimono un biosensore pH, mCherry::pHluorin, immagine biosensore usando la formazione immagine di fluorescenza quantitativa, generare curve standard e convertire i valori di intensità di fluorescenza per valori di pH.

Abstract

Variazioni di pH intracellulare (pHi) svolgono i ruoli importanti nella regolazione di molte funzioni cellulari, compreso il metabolismo, proliferazione e differenziazione. In genere, pHi dinamiche sono determinati in cellule coltivate, suscettibili di misurazione e manipolando sperimentalmente pHi. Tuttavia, il recente sviluppo di nuovi strumenti e metodologie ha permesso di studiare pHi dinamica all’interno del tessuto intatto, vivo. Per la ricerca di Drosophila , uno sviluppo importante è stata la generazione di una linea transgenica che trasportano un biosensore pHi, mCherry::pHluorin. Qui, descriviamo un protocollo che usiamo abitualmente per formazione immagine dal vivo della drosofila ovarioles per misurare pHi del lignaggio di cellule staminali (FSC) epiteliali del follicolo in mCherry::pHluorin linee transgeniche wild-type; Tuttavia, i metodi descritti qui possono essere facilmente adattati per altri tessuti, compreso i dischi di ala e dell’epitelio dell’occhio. Descriviamo tecniche per esprimere mCherry::pHluorin del lignaggio di FSC, mantenimento del tessuto ovarico durante il live di imaging e acquisire ed analizzare le immagini per ottenere i valori di pHi.

Introduction

Studi recenti hanno rivelato un ruolo per le modifiche a pHi durante cellulari displasia e differenziazione in vivo^1,2. Questi studi hanno trovato che pHi è notevolmente coerenti in cellule dello stesso tipo nella stessa fase di differenziazione, ma che cambia come le cellule di transizione da una fase a altra. In alcuni casi, bloccando le modifiche a pHi parzialmente sconvolge la differenziazione, suggerendo che il cambiamento a pHi non è solo una conseguenza di cambiamenti nel destino della cellula ma invece aiuta a promuovere il cambiamento nel destino della cellula, magari attraverso effetti sulla regolamentazione sensibili al pH proteine o reazioni chimiche necessarie per la differenziazione. Gli studi futuri hanno il potenziale per rivelare più comprensione nei molti ruoli diversi di pHi dynamics in vivo. Tuttavia, una delle sfide di studiare pHi durante il differenziamento in vivo è ottenere misurazioni accurate di pHi. A differenza di altre caratteristiche di differenziazione, quali i cambiamenti nella morfologia cellulare e l’espressione genica, pHi è una proprietà chimica labile della cella che non viene mantenuta in cellule che sono stati corretti e permeabilizzate con metodi standard. Inoltre, pHi può non essere stabile in cellule che sono stressate o morente a seguito di manipolazione sperimentale. Pertanto, è importante mantenere le cellule in vivo e sano come possibile durante la misurazione pHi. Diversi coloranti vitali sono disponibili che funzionano bene per misurare il pHi di cellule in cultura³, ma in molti casi essi non sono adatti per in vivo studi perché non penetrano il tessuto profondamente o uniformemente abbastanza per fornire misurazioni accurate .

Per aggirare il problema della penetrazione del colorante scadente, noi ed altri abbiamo usato una sonda codificata geneticamente, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, che può essere espressa in particolare nella cella tipi di interesse e imaged in tessuto vivo. pHluorin è una variante del GFP con un pKa più alto (~ 7.0 vs ~ 4.0) che si piega più facilmente a pH più alto; così l’intensità di fluorescenza totale emessa da una popolazione di molecole di pHluorin nella cella aumenta con l’aumentare di pHi⁸. D’importanza, la fluorescenza è lineare nel range di normalità citosolico di valori di pHi. In contrasto, la fluorescenza della mCherry (pKa ~ 4.5) è insensibile ai cambiamenti di pH all’interno della gamma citosolica. Questi due giornalisti sono covalentemente insieme come una singola proteina chimerica, codificata da un telaio di sola lettura aperta, in modo che sempre sono presenti in quantità uguali. Di conseguenza, il rapporto di pHluorin per l’intensità di fluorescenza mCherry fornisce una misura del pHi che è normalizzato per la concentrazione di sonda in ogni cella. I rapporti possono quindi essere convertiti alle stime dei valori di pHi utilizzando una curva standard che viene generata ottenendo il pHluorin ai rapporti mCherry da tessuti che sono stati equilibrati a valori di pH noto.

Qui, descriviamo i metodi per l’utilizzo di mCherry::pHluorin per misurare il pHi del lignaggio FSC epiteliale nell’ovaia di Drosophila . Questo tessuto ben caratterizzato è stato utilizzato per modellare i diversi aspetti della biologia, epiteliale, quali cellule staminali auto-rinnovamento e differenziazione^9,10,11, migrazione cellulare collettiva¹² , lo sviluppo e la manutenzione del cellulare polarità^13,14. L’epitelio del follicolo è prodotto da due FSCs che risiedono al bordo anteriore del tessuto in una struttura denominata il germarium^15,16. Queste cellule si dividono regolarmente durante l’età adulta di auto-rinnovarsi e produrre prole, chiamate cellule prefollicle (PFC), che possono immettere nuovamente la nicchia e diventare un FSC o differenziarsi in uno dei tre tipi di cellule del follicolo diversi: polare cellule, cellule di gambo, o cellule del follicolo di corpo principale. Abbiamo indicato precedentemente che nel tessuto wildtype, il pHi aumenta costantemente durante le prime fasi di differenziazione, da un pHi di circa 6.8 in FSCs a 7.0 in PFC, a 7,3 nel follicolo celle². Bloccando questo aumento di RNAi atterramento di uno scambiatore sodio/protone espressa ubiquitariamente, DNhe2, severamente altera la differenziazione di pFC, considerando che l’aumento di pHi di sovraespressione di DNhe2 provoca una lieve differenziazione in eccesso fenotipo. Questi risultati dimostrano che pHi è mantenuto stabile nel lignaggio FSC precoce e che può essere sperimentalmente aumentata o diminuita in vivo. I metodi descritti qui possono essere utilizzati per misurare pHi in tessuto wildtype o varie forme di tessuti mutante, compreso atterramento di RNAi o sovraespressione utilizzando un Gal4 di interesse e cloni mitotici.

Protocol

Nota: per misurare pHi del lignaggio di FSC, noi calcolare il rapporto di intensità di fluorescenza di pHluorin a mCherry in FSCs, PFC e le cellule del follicolo in condizioni fisiologiche e convertire i rapporti in valori di pHi con standard curve di calibrazione per ogni cella tipo 7. Primi, live imaging esperimenti sono effettuati per misurare l’intensità di fluorescenza di pHluorin e mCherry in germaria dissecato in un tampone contenente NaHCO 3, che simula condizioni fisiologic…

Representative Results

Qui abbiamo descritto il processo di misurazione pHi nell’epitelio del follicolo, che prevede diversi passaggi. In primo luogo, le ovaie vengono sezionate da mosche del genotipo appropriato utilizzando strumenti per dissezione e montaggio (Figura 1). Le ovarioles sono quindi Imaging utilizzando la microscopia a fluorescenza quantitativa e le immagini vengono analizzati per ottenere misurazioni di pHi. Per ogni immagine, i tipi di cellule di interesse vengono …

Discussion

Qui, descriviamo un metodo per misurare il pHi di cellule del lignaggio di FSC all’interno del tessuto wildtype. Questo protocollo è stato sviluppato e perfezionato negli ultimi cinque anni, da quando abbiamo iniziato a studiare pHi in tessuto ovarico di Drosophila . Durante quel tempo, il protocollo è stato utilizzato con successo da più ricercatori nel nostro laboratorio e su almeno quattro diversi filatura disc e microscopi a scansione laser. La riproducibilità della nostra osservazione originale, che pHi…

Materials

Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3