Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila
Summary
Nós fornecemos um protocolo para o pH intracelular de uma linhagem de células-tronco epiteliais em tecido ovariano de Drosophila vivo de imagem. Descrevemos a métodos para gerar moscas transgênicas expressando um biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagem o biosensor utilizando imagens de fluorescência quantitativa, gerar curvas padrão e converter valores de intensidade de fluorescência para valores de pH.
Abstract
Mudanças no pH intracelular (pHi) desempenham um papel importante na regulação de muitas funções celulares, incluindo o metabolismo, proliferação e diferenciação. Normalmente, pHi dinâmica é determinada em culturas de células, que são passíveis de medição e manipular experimentalmente pHi. No entanto, o recente desenvolvimento de novas ferramentas e metodologias tornou possível estudar a dinâmica de pHi no tecido intacto, ao vivo. Para a investigação de Drosophila , um desenvolvimento importante foi a geração de uma linha de transgénica carregando um biossensor pHi, mCherry::pHluorin. Aqui, descrevemos um protocolo que usamos rotineiramente para imagem ao vivo Drosophila ovarioles para medir pHi na linhagem de células-tronco (FSC) folículo epiteliais em linhas transgénicas tipo selvagem de mCherry::pHluorin; no entanto, os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para outros tecidos, incluindo os discos de asa e o epitélio do olho. Descrevemos técnicas para expressar mCherry::pHluorin na linhagem FSC, mantendo o tecido ovariano durante a imagem latente, ao vivo e aquisição e analisando imagens para obter valores de pHi.
Introduction
Estudos recentes revelaram um papel para alterações em pHi durante celular diferenciação e displasia na vivo1,2. Estes estudos encontraram que pHi é notavelmente consistente nas células do mesmo tipo na mesma fase de diferenciação, mas que muda como células de transição de uma fase para outra. Em alguns casos, bloquear as mudanças na pHi parcialmente interrompe a diferenciação, sugerindo que a mudança na pHi não é apenas uma consequência de alterações no destino da célula, mas em vez disso, ajuda a promover a mudança no destino da célula, talvez através de efeitos no pH sensíveis à regulamentação proteínas ou reações químicas necessárias para diferenciação. Futuros estudos têm o potencial para revelar mais a introspecção as muitos papéis diferentes do pHi dinâmica na vivo. No entanto, um dos desafios de estudar pHi durante a diferenciação na vivo é a obtenção de medições precisas de pHi. Ao contrário de outras características de diferenciação, tais como alterações na morfologia celular e expressão gênica, pHi é uma propriedade química lábil da célula que não é preservada em células que foram fixadas e permeabilizadas com métodos padrão. Além disso, pHi pode não ser estável em células que estão estressadas ou morrendo como resultado de manipulação experimental. Assim, é importante manter as células viva e mais saudável possível quando se mede o pHi. Vários corantes vitais estão disponíveis que funcionam bem para medir o pHi de células em cultura3, mas em muitos casos eles não são adequados na vivo estuda porque eles não penetram o tecido profundamente ou uniformemente o suficiente para fornecer medições precisas .
Para contornar o problema da penetração de corantes pobre, nós e os outros usaram uma sonda geneticamente codificada, mCherry::pHluorin4,5,6,7, que pode ser expressa especificamente na célula tipos de interesse e imagem em tecido vivo. pHluorin é uma variante do GFP com uma mais elevada pKa (~ 7.0 vs ~ 4.0) que dobra mais facilmente em um pH mais elevado; Então, a intensidade de fluorescência total emitida por uma população de moléculas de pHluorin na célula aumenta com o aumento de pHi8. Importante, a fluorescência é linear dentro da normalidade citosólica dos valores de pHi. Em contraste, a fluorescência de mCherry (pKa ~ 4.5) é insensível a mudanças de pH dentro do intervalo citosólica. Estes dois repórteres estão covalentemente ligados juntos como uma única proteína quimérico, codificada por um frame de leitura aberto único, para que eles sempre estão presentes em quantidades iguais. Portanto, a relação de pHluorin para mCherry intensidade de fluorescência fornece uma medida da pHi que é normalizado para a concentração de sonda em cada célula. Os rácios podem ser então convertidos a estimativas de valores de pHi usando uma curva padrão que é gerada, obtendo o pHluorin mCherry rácios de tecidos que tenham sido incubados para valores de pH conhecido.
Aqui, descrevemos os métodos para usar o mCherry::pHluorin para medir o pHi da linhagem epitelial de FSC no ovário drosófila . Este tecido bem caracterizado tem sido usado para modelar diversos aspectos da biologia epitelial, tais como células-tronco auto-renovação e diferenciação9,10,11, migração celular coletiva12 , o desenvolvimento e a manutenção da célula polaridade13,14. O epitélio do folículo é produzido por dois FSCs que residem na borda anterior do tecido em uma estrutura chamada de15,o germarium16. Estas células se dividem regularmente durante a vida adulta para auto renovar e produzir descendência, chamadas células prefollicle (PFC), que podem re-introduzir o nicho e se tornar um FSC ou se diferenciar em um dos três tipos de células do folículo diferentes: as células polares, células do caule, ou células do folículo do corpo principal. Mostramos anteriormente que no tecido de sua, o pHi aumenta progressivamente durante os primeiros estágios de diferenciação, de um pHi de aproximadamente 6,8 na FSCs para 7.0 no PFC, para 7,3 em células de folículo2. Bloquear este aumento por RNAi nocaute de um trocador de sódio/próton ubiquitously expressa, DNhe2, severamente prejudica a diferenciação de pFC, Considerando que aumentando pHi superexpressão de DNhe2 provoca uma leve diferenciação em excesso fenótipo. Estes resultados demonstram que pHi estàvel é mantida na linhagem precoce do FSC e experimentalmente que pode ser aumentado ou diminuído na vivo. Os métodos descritos aqui podem ser usados para medir pHi em sua tecido ou várias formas de tecidos mutantes, incluindo knockdown RNAi ou superexpressão usando um Gal4 de interesse e clones mitóticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um método para medir o pHi de células na linhagem FSC dentro sua tecido. Este protocolo foi desenvolvido e refinado nos últimos cinco anos, desde que primeiro começamos a estudar pHi em tecido ovariano de Drosophila . Durante esse tempo, o protocolo tem sido usado com sucesso por vários investigadores em nosso laboratório e em pelo menos quatro diferentes girando disco e microscópios de exploração do laser. Reprodutibilidade da nossa observação original, que aumenta de pHi como célu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Bryne Ulmschneider contribuições para o protocolo e Diane Barber para sugestões sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado por um Instituto Nacional de subvenção de saúde GM116384 ao Nystul de T.G. e D.L. Barber.
Materials
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
| y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and mounting tools | |||
| 2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
| Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
| Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |
References
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