المستندة إلى صفيف "مقارنة الجينوم التهجين منصة" "الكشف عن كفاءة من نسخ عدد الاختلافات" في طفرات "سريعة النيوترون" المستحثة فصة برميلية
Summary
يوفر هذا البروتوكول خطوات تجريبية ومعلومات حول الكواشف ومعدات وأدوات التحليل للباحثين الذين يرغبون في القيام بتحليل الجينوم كله التهجين الجينومي المقارن القائم على صفيف (CGH) لنسخ عدد الاختلافات في النباتات.
Abstract
هي طفرات لا تقدر بثمن من الموارد الوراثية للدراسات وظيفة الجينات. لإنشاء مجموعات متحولة، يمكن أن تستخدم ثلاثة أنواع من المطفرة، بما في ذلك البيولوجية مثل تي-دنا أو ينقول، أو الكيميائية مثل إيثيل ميثانيسولفوناتي (EMS) أو المادية مثل الإشعاعات التأين. نوع الطفرة لاحظ يتفاوت مطفر المستخدمة. للتأين الإشعاعي الناجم عن طفرات، تشمل طفرات الحذف أو الازدواجية، أو إعادة ترتيب. بينما يقتصر تي-دنا أو الطفرات ينقول المستندة إلى الأنواع التي عرضه للتحول، يمكن تطبيق الطفرات الكيميائية أو الفيزيائية لمجموعة واسعة من الأنواع. ومع ذلك، وصف الطفرات المستمدة من الطفرات الكيميائية أو الفيزيائية تقليديا يعتمد على خريطة نهجاً قائما على استنساخ، وهو العمل المكثف ومضيعة للوقت. وهنا نعرض أن منصة تهجين جينومي مقارن القائم على مجموعة (أكغ) عالي الكثافة جينوم يمكن تطبيقها على الكشف عن كفاءة وتميز الاختلافات نسخة رقم (كنفس) في طفرات المستمدة من الطفرات القصف (ليبونن) النيوترونات السريعة في فصة برميلية، أنواع البقول. تحليل تسلسل الجينوم كله يبين أن هناك جينات أكثر من 50,000 أو نماذج الجينات في م. برميلية. في طفرات الحالية، والتي يسببها ليبونن في برميلية م. مستمدة من أكثر من 150,000 خطوط M1، تمثل الموارد الوراثية لا تقدر بثمن للدراسات الفنية للجينات في الجينوم. منصة أكغ الموصوفة هنا أداة فعالة لوصف طفرات المستحثة ليبونن في م. برميلية.
Introduction
البقوليات (قرنيات) هي ثالث أكبر عائلة النباتات المزهرة، مع العديد من الأنواع الهامة اقتصاديا مثل فول الصويا (ماكس جليكاين) والبرسيم (فصة ساتيفا). نباتات البقول يمكن أن تتفاعل مع البكتيريا التربة النتروجين، تسمى عموما رهيزوبيا لتطوير العقيدات الجذرية التي ينخفض رابع الغلاف الجوي للأمونيا للاستخدام بالنبات المضيف. على هذا النحو، يتطلب إدخال القليل من الأسمدة النيتروجينية زراعة محاصيل البقول وهكذا تسهم الزراعة المستدامة. إنتاج محاصيل البقول الأوراق والبذور ذات محتوى عالي البروتين، تخدم كعلف ممتاز ومحاصيل الحبوب. ومع ذلك، أنواع البقول المزروعة عموما لديهم هياكل معقدة الجينوم، مما يجعل الدراسات الفنية من الجينات التي تلعب أدواراً رئيسية في العمليات الخاصة بالبقول مرهقة. فصة برميلية قد اعتمدت على نطاق واسع كأنواع نموذجية للدراسات البقول أساسا لتكنولوجيا المعلومات (1) يحتوي جينوم مثنوية مع حجم جينوم فرداني صغيرة نسبيا (~ 550 Mbp)؛ (2) نباتات يمكن أن تتحول ستابلي لدراسات الجينات الوظيفية؛ وهو (3) ارتباطاً وثيقا بالبرسيم (م. ساتيفا) والملكة من الأعلاف والعديد من المحاصيل الأخرى الهامة من الناحية الاقتصادية للدراسات متعدية الجنسيات. في الآونة الأخيرة، تسلسل الجينوم والسيرة الذاتية برميلية م. A17 جيمالونج قد صدر1،2. تعليق توضيحي للجينوم تبين أن هناك أكثر من 50,000 الجينات المتوقعة أو نماذج الجينات في الجينوم. لتحديد وظيفة معظم الجينات في برميلية م. المجين مهمة صعبة. لتسهيل الدراسات الفنية للجينات، مجموعة شاملة من طفرات في نطاق الأسطر1 م 150,000 أكثر من تم إنشاؤها باستخدام النيوترونات السريعة القصف (ليبونن) الطفرات في السيرة الذاتية برميلية م. A17 جيمالونج3 ،4. وقد استخدمت النيوترونات السريعة، مطفر تاين ذات طاقة عالية، في توليد طفرات في العديد من الأنواع النباتية بما في ذلك أعطيت5،6،7من الأرز (أرز)، الطماطم (Solanum بندورة)، فول الصويا (سوجا جليكاين؛ زاي ماكس)8،9والشعير (فولغاري شعير) Lotus japonicus10. جزء كبير من الطفرات المستمدة من الطفرات ليبونن هي سبب الحذف الحمض النووي التي تتراوح في حجمها من بضع قاعدة أزواج ميجا قاعدة أزواج9،11. وقد تم العديد من الجينات المرتبطة بالنمط الظاهري بنجاح تحديد ووصف4،،من1213،،من1415،16، 17 , 18 , 19-الاستنساخ الجزيئي للجينات الكامنة من طفرات ليبونن سابقا، تعتمد على نهج قائم على الخريطة، التي تستغرق وقتاً طويلاً، ويحد من العدد طفرات تتسم على المستوى الجزيئي. في الآونة الأخيرة، عدة نهج المجاملة بما في ذلك الأساليب المستندة إلى نص، الجينوم تبليط التهجين الجينومي المقارن القائم على صفيف (CGH) للحمض النووي نسخة رقم الكشف عن الاختلاف، وتسلسل الجينوم كله، قد استخدمت لتسهيل وصف طفرات الحذف في الكائنات المتنوعة بما في ذلك الحيوانات والنباتات20،،من2122،،من2324،25، 26،27،،من2829،،من3031.
تيسيرا لتوصيف طفرات ليبونن في م. برميلية، كل الجينوم المستندة إلى صفيف مقارنة الجينوم تهجين (CGH) وضعت منصة والتحقق من صحتها. كما ورد في النظم الحيوانية، منصة CGH المستندة إلى الصفيف يتيح الكشف عن تغيرات نسخة رقم (كنفس) على مستوى كامل الجينوم في طفرات ليبونن برميلية م. . وعلاوة على ذلك، آفات يمكن أن تؤكده بكر ويمكن تحديد حدود الحذف بالتسلسل. عموما، منهاج CGH صفيف أداة كفؤة وفعالة في تحديد الآفات في طفرات ليبونن م. برميلية . ويوضح هنا، الصفيف CGH الإجراءات وتوصيف PCR الحدود الحذف في المسخ ليبونن برميلية م. .
وينص البروتوكول التالية خطوات تجريبية ومعلومات حول الكواشف ومعدات وأدوات التحليل للباحثين الذين يرغبون في القيام بتحليل الجينوم كله التهجين الجينومي المقارن القائم على صفيف (CGH) من عدد النسخ الاختلافات في النباتات. على سبيل مثال، استخدمت فصة برميلية FN6191 المسخ لتحديد مناطق الحذف والجينات المرشحة المقترنة تعمل متحولة. برميلية م. FN6191 متحولة، معزولة أصلاً من جمع متحولة حذف التي يسببها القصف النيوترونات سريعة32 (انظر الجدول للمواد)، عرضت النمط الظاهري فرط نودوليشن بعد التطعيم بالتربة بكتيريا، Sm1021 الرايزوبيوم سيهورهيزوبيوم ، وعلى النقيض من النباتات البرية نوع.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قمنا بتطوير منصة CGH المستندة إلى الصفيف للكشف ووصف القصف النيوترونات السريعة (ليبونن)-التي يسببها طفرات في عام م. برميلية A17 جيمالونج. للتدليل على استخدام صفيف الأسلوب CGH في الكشف عن الطفرات الجينية، أجرينا تحليلاً أكغ للمسخ FN6191، التي عرضت النمط الظاهري فرط نودولاتيون خلافا للنبات…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل هو توفير التمويل جزئيا بمنحه من “جبهة الخلاص الوطني محطة أبحاث الجينوم” (دائرة الرقابة الداخلية–1127155).
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
References
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. 유전학. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
