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유전학

Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula

Published: November 08, 2017
doi:
10.3791/56470
, , , , ,
1Laboratory of Plant Genetics and Development,Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory,University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School,Li Shui University

Summary

Ce protocole donne des mesures expérimentales de réactifs, équipements et outils d’analyse pour les chercheurs qui s’intéressent à effectuer du génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) analyse des variations numéros de copie plantes.

Abstract

Les mutants sont inestimables ressources génétiques pour les études de fonction de gènes. Pour générer des collections de mutants, trois types d’agents mutagènes peuvent être utilisés, y compris biologiques telles que l’ADN-T ou transposon, chimique notamment le méthanesulfonate d’éthyle (EMS), ou physique comme le rayonnement de l’ionisation. Le type de mutation observée varie selon le mutagène utilisé. Des mutants de rayonnement induit par ionisation, mutations incluent délétion, duplication ou réarrangement. T-DNA ou mutagenèse axée sur le transposon est limitée aux espèces qui sont sensibles à la transformation, mutagenèse chimique ou physique peut être appliquée à une vaste gamme d’espèces. Cependant, la caractérisation des mutations dérivé de mutagenèse chimique ou physique traditionnellement repose sur une approche de clonage positionnel, qui est le travail intensif et beaucoup de temps. Ici, nous montrons qu’une plate-forme de basées sur l’hybridation génomique comparative (aCGH) haute densité génome peut être appliquée pour efficacement détecter et caractériser les variations numéros copie (CNV) chez les mutants dérivés de mutagénèse de bombardement (FNB) de neutrons rapides dans Medicago truncatula, une espèce de légumineuse. Le séquençage du génome entier montre qu’il n’y a plus de 50 000 gènes ou modèles de gènes chez le M. truncatula. À présents, induite par le FNB mutants chez le M. truncatula proviennent de plus de 150 000 lignes M1, ce qui représente de précieuses ressources génétiques pour l’étude fonctionnelle de gènes dans le génome. La plate-forme aCGH décrite ici est un outil efficace pour la caractérisation des mutants induite par le FNB chez le M. truncatula.

Introduction

Légumineuses (Fabaceae) sont la troisième plus grande famille de plantes dicotylédones, avec de nombreuses espèces économiquement importantes telles que le soja (Glycine max) et de la luzerne (Medicago sativa). Plantes légumineuses peuvent interagir avec les bactéries du sol fixatrices d’azote, généralement appelées Rhizobia pour développer des nodules racinaires où le diazote atmosphérique est réduit à l’ammoniaque pour utilisation par la plante-hôte. Ainsi, la culture des légumineuses nécessite peu d’apport d’engrais azotés et contribue ainsi à une agriculture durable. Les cultures de légumineuses produisent des feuilles et les graines à haute teneur en protéines, servant d’excellents fourrages et de céréales. Cependant, les espèces de légumineuses cultivées ont généralement des structures génome complexe, faisant des études fonctionnelles des gènes qui jouent un rôle clé dans les processus de légumineuses spécifiques encombrants. Medicago truncatula a été largement adopté comme espèce modèle pour des études de légumineuse essentiellement parce que (1) il possède un génome diploïde avec une taille de génome haploïde relativement faible (~ 550 Mbp) ; (2) plantes peuvent être stablement transformés pour des études fonctionnelles de gène ; et (3), il est étroitement lié à la luzerne (M. sativa), la Reine des plantes fourragères et de nombreuses autres cultures d’importance économique pour études translationnelles. Récemment, la séquence du génome de M. truncatula cv Jemalong A17 a été libéré1,2. Annotation du génome montre qu’il n’y a plus de 50 000 gènes prédits ou modèles de gène dans le génome. Pour déterminer la fonction de la plupart des gènes chez le M. truncatula génome est une tâche difficile. Afin de faciliter les études fonctionnelles des gènes, une vaste collection de mutants de l’ordre de plus 150 000 lignes de1 M a été générée à l’aide de mutagénèse de bombardement (FNB) de neutrons rapides dans M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Neutrons rapides, mutagène haute énergie d’ionisation, a été utilisé dans la génération de mutants chez de nombreuses espèces végétales dont Arabidopsis5,6,7de riz (Oryza sativa), tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. max)8,9, orge (Hordeum vulgare) et Lotus japonicus10. Une grande partie des mutations dérivé de mutagenèse FNB résultent de destructions d’ADN qui varient en taille de quelques paires de bases au mega paires de bases9,11. De nombreux gènes associés à phénotype ont été correctement identifié et caractérisé les4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. auparavant, le clonage moléculaire des gènes sous-jacents des mutants de la FNB s’est fondé sur une approche axée sur la carte, ce qui prend du temps et limite le nombre de mutants à être caractérisée au niveau moléculaire. Récemment, plusieurs approches complémentaires y compris des méthodes axées sur la transcription, génome revêtement basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) pour la détection de variation numéro copie l’ADN et le séquençage du génome entier, ont été employée pour faciliter la caractérisation de mutants de délétion dans divers organismes, y compris les animaux et les plantes20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

Afin de faciliter la caractérisation de mutants FNB chez M. truncatula, une génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) plate-forme a été développée et validée. Tel que rapporté dans les systèmes animaux, la plate-forme CGH array permet de détecter des variations nombre de copie (CNV) au niveau du génome chez les mutants FNB M. truncatula . En outre, des lésions peuvent être confirmées par PCR et frontières de suppression peuvent être identifiés par séquençage. Dans l’ensemble, la plate-forme CGH array est un outil efficace pour identifier les lésions chez les mutants FNB M. truncatula . Ici, la procédure CGH array et la caractérisation de la PCR des frontières de suppression dans un mutant FNB M. truncatula sont illustrées.

Le protocole suivant donne les étapes expérimentales de réactifs, équipements et outils d’analyse pour les chercheurs qui s’intéressent à réaliser l’analyse du génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) du nombre de copies variations dans les plantes. À titre d’exemple, Medicago truncatula FN6191 mutant a été utilisé pour identifier les régions de suppression et de gènes candidats associées aux phénotypes mutants. M. truncatula FN6191 mutant, isolé à l’origine d’un neutron rapide suppression induite par le bombardement mutant collection32 (voir Table des matières), présentaient un phénotype hyper nodulation après inoculation avec le sol bactérie, Sihorhizobium meliloti Sm1021, contrairement aux plantes de type sauvage.

Protocol

Remarque : la Figure 1 illustre les cinq étapes pour le tableau protocole CGH. Ils sont : 1) préparation du matériel végétal ; 2) isolation haute qualité d’échantillons d’ADN ; Labeling 3) et la purification des échantillons d’ADN ; 4) hybridation, lavage et balayage des tableaux du génome entier ; et 5) analyse de données HGC. Tableaux de carrelage pour le génome entier M. truncatula contiennent un total de 971 041 sondes oligo unique ciblant plus de 50 000…

Representative Results

La figure 2 montre la répartition des ratios2 journal normalisée du mutant contre WT signaux au sein du génome entier. Analyse des données CGH a révélé une approximation annoté de 22KO délétion sur le chromosome 4 qui englobe l’ ensemble du gène SUNN 33 et plusieurs autres gènes chez le mutant FN6191 (Figure 2, Figure 3). La région candidate po…

Discussion

Nous avons développé une plate-forme CGH array pour la détection et la caractérisation du bombardement de neutrons rapides (FNB)-induite des mutants chez M. truncatula CV Jemalong A17. Pour illustrer l’utilisation du tableau méthode CGH dans la détection des mutations du gène, nous avons réalisé aCGH analyse du mutant FN6191, qui présentaient un phénotype hyper nodulation contrairement aux plantes de type sauvage, lorsqu’ils sont inoculés avec S. meliloti Sm1021. Pour l’analyse de la s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De ce travail est financé en partie par une subvention de NSF Plant Genome Research (IOS-1127155).

Materials

Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9
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References

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Keywords: Array-based Comparative Genomic HybridizationCopy Number VariationsFast Neutron-induced MutantsMedicago TruncatulaLegume BiologyNodule DevelopmentDNA ExtractionDNA LabelingDNA Purification
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Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).
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