Una basata su Array Comparative Genomic ibridazione piattaforma per efficiente rilevamento di copia numero variazioni nei mutanti veloce neutrone-indotta Medicago truncatula
Summary
Questo protocollo fornisce la procedura sperimentale e informazioni su reagenti, attrezzature e strumenti di analisi per i ricercatori che sono interessati a effettuare analisi di ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice di intero genoma di variazioni del numeri di copie in piante.
Abstract
I mutanti sono risorse inestimabili genetiche per gli studi di funzione del gene. Per generare collezioni mutante, tre tipi di agenti mutageni possono essere utilizzati, tra cui biologico come T-DNA o trasposoni, chimiche quali methanesulfonate etilico (EMS) o fisici come le radiazioni di ionizzazione. Il tipo di mutazione osservata varia a seconda del mutageno utilizzato. Per ionizzazione indotta da radiazioni mutanti, mutazioni includono l’eliminazione, la duplicazione o la riorganizzazione. Mentre è limitata alle specie che sono suscettibili di trasformazione T-DNA o basati su trasposone mutagenesi, mutagenesi chimica o fisica può essere applicata a una vasta gamma di specie. Tuttavia, la caratterizzazione delle mutazioni derivato da mutagenesi chimica o fisica tradizionalmente si basa su un approccio di clonazione sulla mappa, che è lavoro intensivo e richiede tempo. Qui, indichiamo che una piattaforma basata su array ibridazione genomica comparativa (CGH) genoma ad alta densità può essere applicata per rilevare e caratterizzare le variazioni del numero di copia (CNV) in mutanti derivati da mutagenesi di bombardamento (FNB) di neutroni veloci in efficacemente Medicago truncatula, una specie di legume. Analisi di sequenza del genoma intero dimostra che ci sono più di 50.000 geni o modelli di gene in M. truncatula. Mutanti presenti, FNB-indotta in M. truncatula sono derivati da più di 150.000 linee M1, che rappresentano preziose risorse genetiche per studi funzionali dei geni nel genoma. La piattaforma di aCGH descritta qui è un efficace strumento per la caratterizzazione di mutanti FNB-indotta in M. truncatula.
Introduction
Leguminose (Fabaceae) sono la terza più grande famiglia di piante fiorite, con molte specie economicamente importanti come soia (Glycine max l.) e l’erba medica (Medicago sativa). Piante leguminose possono interagire con azoto-fissazione di batteri del suolo, generalmente chiamato Rhizobia a sviluppare noduli radice in cui il dinitrogen atmosferici sono ridotti ad ammoniaca per uso di pianta ospite. Come tale, coltivazione delle leguminose richiede poco input di fertilizzanti azotati e contribuisce così all’agricoltura sostenibile. Leguminose producono foglie e semi ad alto contenuto proteico, che funge da ottimo foraggio e cereali. Tuttavia, specie di legume coltivato hanno generalmente strutture complesso genoma, rendendo gli studi funzionali di geni che svolgono un ruolo chiave nei processi specifici del legume ingombranti. Medicago truncatula è stato ampiamente adottato come una specie di modello per studi di legume, principalmente perché (1) ha un genoma diploide con una dimensione relativamente piccola del genoma aploide (~ 550 Mbp); (2) piante possono essere trasformate stabilmente per studi funzionali del gene; e (3) si è collegato strettamente a erba medica (M. sativa), la Regina dei foraggi e molte altre colture economicamente importante per studi traslazionali. Recentemente, la sequenza del genoma di M. truncatula cv Jemalong A17 è stato rilasciato1,2. Annotazione del genoma Mostra che ci sono più di 50.000 geni predetti o modelli di gene nel genoma. Per determinare la funzione della maggior parte dei geni in M. truncatula genoma è un compito impegnativo. Per facilitare gli studi funzionali dei geni, una vasta collezione di mutanti nella gamma di oltre 150.000 M1 linee è stata generata utilizzando mutagenesi di bombardamento (FNB) di neutroni veloci in M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Neutroni veloci, un mutageno di ionizzazione ad alta energia, sono stato utilizzato nella generazione di mutanti in molte specie di piante tra cui Arabidopsis5,6, riso (Oryza sativa)7, pomodoro (Solanum lycopersicum), soia (Glycine soja; G. max)8,9, orzo (Hordeum vulgare) e Lotus japonicus10. Una grande parte delle mutazioni derivato da mutagenesi FNB sono a causa di omissioni del DNA che variano in dimensioni da poche coppie di basi a mega paia di basi9,11. Molti geni associati al fenotipo sono stati correttamente identificato e caratterizzato4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. in precedenza, clonazione molecolare dei geni sottostanti da mutanti FNB invocata da un approccio basato su mappa, che richiede tempo e limita il numero di mutanti per essere caratterizzata a livello molecolare. Recentemente, diversi approcci gratuiti inclusi metodi basati sulla trascrizione, genoma affiancamento ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice per la rilevazione del DNA copia numero variazione e sequenziamento del genoma intero, è stato impiegato per facilitare il caratterizzazione di mutanti di delezione in diversi organismi, tra cui animali e piante20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
Per facilitare la caratterizzazione di mutanti FNB in M. truncatula, un intero genoma basata su array ibridazione genomica comparativa (CGH) piattaforma è stato sviluppato e convalidato. Come riportato in sistemi animali, la piattaforma CGH array-based permette la rilevazione di variazioni del numeri di copie (CNV) a livello di intero genoma nei mutanti di M. truncatula FNB. Inoltre, le lesioni possono essere confermate mediante PCR e bordi di eliminazione possono essere identificati mediante sequenziamento. Nel complesso, la piattaforma CGH array è uno strumento efficiente ed efficace nell’identificazione delle lesioni nei mutanti di M. truncatula FNB. Qui, la procedura CGH array e la caratterizzazione di PCR delle frontiere di eliminazione in un mutante di M. truncatula FNB sono illustrati.
Il seguente protocollo vengono fornite procedure sperimentali e informazioni su reagenti, apparecchiature e strumenti di analisi per i ricercatori che sono interessati a effettuare analisi di ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice di intero genoma di numero di copia variazioni nelle piante. Ad esempio, Medicago truncatula FN6191 mutante è stato utilizzato per identificare regioni di eliminazione e geni candidati associati con fenotipi mutanti. M. truncatula FN6191 mutante, originariamente isolato da un neutrone veloce eliminazione indotta da bombardamento mutante collezione32 (Vedi Tabella materiali), hanno esibito un fenotipo iper-nodulazione dopo l’inoculazione con il terreno batterio, meliloti Sihorhizobium Sm1021, in contrasto con piante di tipo selvaggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato una piattaforma CGH array-based per la rilevazione e la caratterizzazione di bombardamento di neutroni veloci (FNB)-indotta di mutanti di M. truncatula CV Jemalong A17. Per illustrare l’utilizzo della matrice metodo CGH nella rilevazione di mutazioni del gene, abbiamo effettuato l’analisi di aCGH del mutante FN6191, che ha esibito un fenotipo iper-nodulazione in contrasto con piante di tipo selvaggio, quando inoculati con S. meliloti Sm1021. Per le analisi di segmentazione, un segment…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamento di questo lavoro è fornito in parte da una sovvenzione da NSF Plant Genome Research (IOS-1127155).
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
References
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. 유전학. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
