Denne protokol giver eksperimenterende trin og oplysninger om reagenser, udstyr og værktøjer til analyse for forskere, der er interesseret i gennemføre samlede genom array-baserede komparativ genomisk hybridisering (CGH) analyse af kopi nummer variationer i planter.
Mutanter er uvurderlige genetiske ressourcer for gen funktion undersøgelser. For at generere mutant samlinger, kan tre typer af mutagener udnyttes, herunder biologiske såsom T-DNA eller transposon, kemiske såsom ethyl methanesulfonate (EMS), eller fysisk såsom ioniserende stråling stråling. Typen af mutation observeret varierer afhængigt af den mutagen anvendes. For ioniserende stråling stråling induceret mutanter omfatter mutationer sletning, kopiering eller omlægning. Mens T-DNA eller transposon-baserede mutagenese er begrænset til arter, der er modtagelige for forandring, kan kemiske eller fysiske mutagenese anvendes til en bred vifte af arter. Men karakterisering af mutationer afledt af kemiske eller fysiske mutagenese traditionelt bygger på en kort-baseret kloning tilgang, der er arbejdskraft intensiv og tidskrævende. Her viser vi, at en high-density genom array-baserede komparativ genomisk hybridisering (aCGH) platform kan anvendes til effektivt at afsløre og karakterisere kopi nummer variationer (CNVs) i mutanter afledt af hurtig neutron bombardement (FNB) mutagenese i Medicago truncatula, en bælgplante arter. Hele genomet Sekvensanalyse viser, at der er mere end 50.000 gener eller gen modeller i M. truncatula. På nuværende, FNB-induceret mutanter i M. truncatula er afledt af mere end 150.000 M1 linjer, der repræsenterer uvurderlige genetiske ressourcer for funktionelle studier af gener i genomet. ACGH platformen beskrevet her er et effektivt redskab til kendetegner FNB-induceret mutanter i M. truncatula.
Bælgplanter (ærteblomstfamilien) er den tredjestørste familie af dækfrøede planter, med mange økonomisk vigtige arter såsom sojabønner (Glycine max) og lucerne (Medicago sativa). Bælgplanter planter kan interagere med kvælstofbindende jord bakterier, generelt kaldet Rhizobia at udvikle rodknolde, hvor de atmosfæriske dinitrogenoxider er reduceret til ammoniak til brug af anlægget vært. Som sådan, dyrkning af bælgplanter afgrøder kræver lidt input af kvælstofgødning og dermed bidrager til bæredygtigt landbrug. Bælgplanter afgrøder producere blade og frø med højt proteinindhold, der tjener som udmærkede foder og korn afgrøder. Dyrkede bælgplanter arter har dog generelt kompleks genom strukturer, at funktionelle studier af gener, der spiller vigtige roller i bælgplanter-specifikke processer besværlige. Medicago truncatula er blevet bredt vedtaget som en model art for bælgplanter undersøgelser, primært fordi (1) det har en diploide genom med en relativt lille haploide genom størrelse (~ 550 Mbps); (2) planter kan blive stabilt omdannet til gen funktionelle studier; og (3) når det er nært beslægtet med Lucerne (M. sativa), Dronningen af foderafgrøder og mange andre økonomisk vigtige afgrøder for Translationel undersøgelser. For nylig, genomet sekvens af M. truncatula cv Jemalong A17 har været frigivet1,2. Anmærkning af genom viser, at der er mere end 50.000 forudsagte gener eller gen modeller i genomet. For at bestemme funktionen af de fleste af gener i M. truncatula er genom en udfordrende opgave. For at lette funktionelle studier af gener, der er oprettet en omfattende samling af mutanter i rækken af mere end 150.000 M1 linjer ved hjælp af hurtig neutron bombardement (FNB) mutagenese i M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Hurtig neutron, en høj energi ionisering mutagen, har været brugt til at generere mutanter i mange plantearter, herunder Arabidopsis5,6, ris (Oryza sativa)7, tomat (Solanum lycopersicum), sojabønner (Glycine soja; G. max)8,9, byg (Hordeum vulgare) og Lotus japonicus10. En stor del af mutationer afledt af FNB mutagenese skyldes DNA sletninger der spænder i størrelse fra et par basepar til mega basepar9,11. Mange fænotype-associerede gener er blevet identificeret og karakteriseret4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. tidligere, Molekylær kloning af de underliggende gener fra FNB mutanter har påberåbt sig en kort-baseret tilgang, som er tidskrævende og begrænser antallet af mutanter at være kendetegnet på molekylært niveau. For nylig, flere gratis metoder herunder udskrift-baserede metoder, genom flisebelægning array-baserede komparativ genomisk hybridisering (CGH) for DNA copy number variation påvisning og hele genome sequencing, har været ansat til at lette de karakterisering af sletning mutanter i forskellige organismer, herunder dyr og planter20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
For at lette karakterisering af FNB mutanter i M. truncatula, en helhed-genom array-baserede komparativ genomisk hybridisering (CGH) er platform udviklet og valideret. Som rapporteret i animalsk systemer, array-baserede CGH platform giver mulighed for påvisning af kopi nummer variationer (CNVs) på det samlede genom niveau i M. truncatula FNB mutanter. Derudover læsioner kan bekræftes ved PCR og sletning grænser kan identificeres af sekventering. Samlet set er array CGH platform et effektivt værktøj til at identificere læsioner i M. truncatula FNB mutanter. Her, er array CGH procedure og PCR karakterisering af sletning grænser i en M. truncatula FNB mutant illustreret.
Følgende protokol giver eksperimenterende trin og oplysninger om reagenser, udstyr og værktøjer til analyse for forskere, der er interesseret i at foretage samlede genom array-baserede komparativ genomisk hybridisering (CGH) analyse af kopi nummer variationer i planter. Som et eksempel, blev Medicago truncatula FN6191 mutant brugt til at identificere sletning regioner og kandidat gener forbundet med mutant fænotyper. M. truncatula FN6191 mutant, oprindeligt isoleret fra en hurtig neutron bombardement-induceret sletning mutant samling32 (Se Tabel af materialer), udstillet en hyper-nodulation fænotype efter podning med jorden bakterien, Sihorhizobium meliloti Sm1021, i modsætning til vildtype planter.
Vi har udviklet en array-baserede CGH platform til påvisning og karakterisering af hurtig neutron bombardement (FNB)-induceret mutanter i M. truncatula cv. Jemalong A17. For at demonstrere brugen af array CGH metode til at opdage genmutationer, udførte vi aCGH analyse af mutant FN6191, som udstillede en hyper-nodulation fænotype i modsætning til vildtype planter, når podet med S. meliloti Sm1021. Segmenteringsanalyse, et segment var anses for væsentlig, hvis log2 forhold betyde af sonde…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen af dette arbejde er fastsat i en del af et tilskud fra NSF plante genomforskning (IOS-1127155).
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
Laser scanner | Roche | MS200 | |
NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |