Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten
Summary
Dit protocol biedt experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het hele genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) analyse van kopie nummer variaties in uit te voeren planten.
Abstract
Mutanten zijn onschatbare waarde genetische hulpbronnen voor gene functie studies. Voor het genereren van mutant collecties, kunnen drie soorten mutagene agentia worden gebruikt, met inbegrip van biologische zoals T-DNA of transposon, zoals ethyl methanesulfonate (EMS) chemische of fysische zoals ionisatie straling. Het soort mutatie waargenomen varieert afhankelijk van de mutagene stof gebruikt. Mutaties omvatten ionisatie straling geïnduceerde mutanten, verwijdering, duplicatie of omlegging. Terwijl T-DNA of op basis van transposon mutagenese beperkt tot de soorten die vatbaar voor transformatie is zijn, kan chemische of fysische mutagenese worden toegepast op een breed scala van soorten. De karakterisering van mutaties afgeleid van chemische of fysische mutagenese traditioneel is echter afhankelijk van een kaart-gebaseerde klonen benadering die arbeid intensief en tijdrovend is. Hier, laten we zien dat een high-density genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (aCGH) platform kan worden toegepast om efficiënt detecteren en karakteriseren van kopie aantal variaties (CNVs) in mutanten afgeleid van snelle neutronen bombardement (FNB) mutagenese in Medicago truncatula, een peulvrucht soorten. Volledige genoomanalyse van de reeks toont aan dat er meer dan 50.000 genen of gene modellen in M. truncatula. Bij de huidige, FNB-geïnduceerde mutanten in M. truncatula zijn afgeleid van meer dan 150.000 M1 lijnen, die van onschatbare waarde plantgenetische hulpbronnen voor functionele studies van genen in de genoom. Het platform van de aCGH hier beschreven is een doeltreffend instrument voor het karakteriseren van FNB-geïnduceerde mutanten in M. truncatula.
Introduction
Peulvruchten (Fabaceae) is de derde grootste familie van tweezaadlobbige planten, met vele economisch belangrijke soorten zoals sojabonen (Glycine max) en luzerne (Medicago sativa). Peulvruchten planten kunnen communiceren met stikstof-vaststelling bodem bacteriën, Rhizobium om root knobbeltjes waarin de atmosferische dinitrogen is gereduceerd tot ammoniak voor gebruik door de waardplant genoemd. Als zodanig, teelt van peulvruchten gewassen vereist weinig inbreng van stikstof meststoffen en draagt aldus bij aan duurzame landbouw. Peulvruchten gewassen produceren bladeren en zaden met een hoog eiwitgehalte, bijeenkomen uitstekend ruwvoer en graan gewassen. Gecultiveerde peulvrucht soorten hebben echter over het algemeen complex genoom structuren, functionele studies van genen die spelen een sleutelrol in peulvruchten-specifieke processen omslachtig maken. Medicago truncatula is wijd goedgekeurd als een soort model voor peulvruchten studies vooral omdat (1) het heeft een diploïde genoom met een relatief kleine haploïde genoom grootte (~ 550 Mbp); (2) planten kunnen stabiel worden omgezet voor gene functionele studies; en (3) het is nauw verwant aan alfalfa (M. sativa), de koningin van voedergewassen en vele andere economisch belangrijke gewassen voor translationeel onderzoek. Onlangs, het genoom van M. truncatula cv Jemalong A17 geweest vrijgegeven1,2. Annotatie van het genoom laat zien dat er meer dan 50.000 voorspelde genen of modellen van het gen in het genoom. Om te bepalen van de functie van de meeste van de genen in de M. truncatula is genoom een uitdagende taak. Ter vergemakkelijking van functionele studies van genen, een uitgebreide verzameling van mutanten in het bereik van meer dan 150.000 M1 lijnen is gegenereerd met behulp van snelle neutronen bombardement (FNB) mutagenese in M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Snelle neutronen, een energierijke ionisatie mutageen, is gebruikt bij het genereren van mutanten in vele plantensoorten met inbegrip van Arabidopsis5,6, rijst (Oryza sativa)7, tomaat (Solanum lycopersicum), sojabonen (Glycine soja; G. max)8,9, gerst (Hordeum vulgare), en Lotus japonicus10. Een groot deel van mutaties afgeleid van FNB mutagenese zijn als gevolg van DNA deleties die variëren in grootte van een paar basenparen op mega basenpaar9,11. Vele fenotype-geassocieerde genen met succes zijn geïdentificeerd en gekarakteriseerd4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. eerder, moleculaire klonen van de onderliggende genen van FNB mutanten vertrouwd op een kaart gebaseerde benadering, die is tijdrovend en beperkt het aantal mutanten te worden gekenmerkt op moleculair niveau. Onlangs, verscheidene gratis benaderingen, met inbegrip van transcriptie gebaseerde methoden, genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) voor DNA kopie nummer variatie detectie, en hele genoom sequencing, plavuizen zijn tewerkgesteld te vergemakkelijken de karakterisering van schrapping mutanten in verschillende organismen, met inbegrip van dieren en planten20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
Om te vergemakkelijken de karakterisatie van FNB mutanten in M. truncatula, een geheel-genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) is platform ontwikkeld en gevalideerd. Zoals gemeld in dierlijke systemen, maakt het platform CGH arraygebaseerd de ontdekking van kopie aantal variaties (CNVs) op het niveau van de hele genoom in M. truncatula FNB mutanten. Bovendien, letsels kunnen worden bevestigd door PCR en schrapping grenzen kunnen worden geïdentificeerd door sequentiebepaling. Over het geheel genomen is de matrix CGH platform een efficiënte en effectieve hulpmiddel bij het identificeren van de laesies in M. truncatula FNB mutanten. Hier, worden de matrix CGH procedure en PCR karakterisering van schrapping grenzen in een M. truncatula FNB mutant geïllustreerd.
Het volgende protocol voorziet experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van volledige genoomanalyse arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) van exemplaaraantal variaties in planten. Als voorbeeld, werd Medicago truncatula FN6191 mutant gebruikt om te identificeren schrapping regio’s en de kandidaat-genen mutant fenotypen is gekoppeld. M. truncatula FN6191 mutant, oorspronkelijk geïsoleerd van een snelle neutronen schrapping bombardement-geïnduceerde gemuteerde collectie32 (Zie Tabel of Materials), een hyper-nodulatie fenotype tentoongesteld na inoculatie met de bodem bacterie, Sihorhizobium meliloti heeft Sm1021, in tegenstelling tot wild type planten.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een arraygebaseerd CGH platform ontwikkeld voor de detectie en karakterisatie van snelle neutronen bombardement (FNB)-geïnduceerde mutanten in M. truncatula cv. Jemalong A17. Om aan te tonen het gebruik van de array CGH methode voor het opsporen van genmutaties, we aCGH analyse van de mutant FN6191, die tentoongesteld van een hyper-nodulatie fenotype in tegenstelling tot wild type planten, wanneer geënt met S. meliloti Sm1021uitgevoerd. Voor segmentatie analyse, werd een segment beschouwd al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering van dit werk wordt geleverd ten dele door een subsidie van NSF plantenonderzoek genoom (IOS-1127155).
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
References
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. 유전학. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
