Summary

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

Published: January 28, 2018
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Summary

이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.

Abstract

DNA 얼룩 메서드는 생물 의학 연구에 매우 중요 하다. 우리 설계 색된 침전의 형성에 의해 육안으로 DNA 시각화를 허용 하는 간단한 방법. 아크릴 아 미드를 몸을 담글 하 여 작동 또는 agarose DNA SYBR 녹색 1 x (2.0 µ M에 해당)의 해결책에 있는 젤 나 (SG 나) 보라색을 생성 하는 0.20 m m 블루 니트로 tetrazolium formazan 햇빛에 드러낼 때의 침전 또는 특별히 라이트 블루. 또한, DNA 복구 테스트가 우리의 방법으로 얼룩진 agarose 젤에는 암 피 실린 내성 플라스 미드를 사용 하 여 수행 되었습니다. 식민지의 많은 수와 함께 전통적인 보다 우리의 방법으로 얻은 SG를 사용 하 여 얼룩이 나 자외선 조명. 설명된 방법, 특정, 및 비-독성 DNA 검색, 시각화는 transilluminator 없이 “육안” 생체의 수 이며 저렴 하 고 필드 사용에 대 한 적절 한입니다. 이러한 이유로, 우리의 새로운 DNA 방법 얼룩이 지는 연구와 산업에 잠재적인 이점이 있습니다.

Introduction

생화학과 분자 생물학의 발전, DNA와 관련 된 연구는 DNA 분석을 더 나은 기술을 요구 했다. DNA 얼룩에 대 한 첫 번째 방법은 실버 얼룩, 매우 민감한 하지만 부족 선택 이었고 샘플 복구를 허용 하지 않습니다. 나중에, 형광 DNA 얼룩의 개발 샘플 복구의 가능성과 함께 DNA의 선택적 정량화를 허용. 첫 번째 형광 염료 DNA 정량화 사용 중 하나는 돌연변이2ethidium 평범한 사람1, 이었다.입니다. 그러나, 이제는 안전 하 고 더 민감한, GelRed, SYBR 녹색 등 향상 된 형광 염료 나 (SG 나)3; 그러나 모두 이러한 형광 염료의 자외선 (UV) transilluminator 또는 fluorimeter의 사용을 요구 한다.

가시 메 틸 렌 블루4 등 크리스탈 바이올렛5,6,7,,89, DNA, 얼룩에 대 한 다른 기술이 있다 하지만 이러한 모든 감소 된 감도에서 고통 및 선택도입니다. Tetrazolium 소금은 유기 화합물 감소, 취약 하 고이 경우 그들은 형성 된 불용 성 색된 formazan 침전10,11. 최근, 일부가 tetrazolium 소금 그들의 긍정적인 tetrazolium 반지12때문에 DNA에 바인딩할 표시 되었습니다.

최근 게시13, 얼룩 polyacrylamide 젤에서 DNA를 계량 하는 새로운 표시 기술 제안 했다, 니트로 블루 tetrazolium (NBT) 불리고 ethidium 평범한 사람, GelRed, 같은 형광 염료가 tetrazolium 소금의 감소를 사용 하 여 SYBR 녹색 어 SYBR 골드. 푸른 빛 또는 햇빛 있을 때 일을 하 고 향상 된 품질로 샘플 복구 허용이 반응에 비해 SG 사용 하 여 나 UV transilluminator와 함께. 이 문서의 목적은 tetrazolium를 사용 하 여 착 색 기술의 상세한 프로토콜 제공 하 염입니다.

Protocol

1. 준비 하 고 실행 하는 젤 비 변성 시키기 12 %polyacrylamide 젤 젤 Sambrook와 러셀14 에 찾았지만 SDS 대신 물을 사용 하 여 나트륨 라우릴 황산 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 제조 법을 사용 하 여 준비 합니다. 젤을 해결의 5 mL를 준비 하려면 1.7 mL 증류수, 아크릴 아 미드/비스 아크릴 아 미드 (30/0.8 %w / v)의 2 개 mL, 1.5 M Tris pH 8.8의 1.3 mL, 10% 염화 persulfate의 0.05 mL 및 0.002 m…

Representative Results

자주색 formazan 침전 (질량 분석13확인) DNA는 나타납니다. 실험에서 DNA 사다리 보정 곡선 (그림 3)을 로드 했습니다. 아크릴 및 agarose 젤에 대 한 프로토콜 작동 하지만 낮은 강도 있으며 agarose에서 더 긴 시간이 걸립니다. 그러나, agarose 젤의 사용 수 상용 키트를 사용 하 여 샘플의 복구 하 고 추출을 방해 하지 않습니다. 블루 Led와 함께…

Discussion

소설과 민감한 DNA 방법 얼룩 NBT의 감소 및이 문서에서 제시 했다 SG의 사용에 따라. 이 프로토콜에서 중요 한 단계는 NBT SG에 젤의 부 화 시간이 나 솔루션 및 NBT의 농도. Agarose 젤에 대 한 착 시간 agarose 젤 큰 두께 때문에 아크릴 아 미드 젤에 대 한 이상 이다. 이 메서드는 NBT 그것 접촉 침전으로 SDS 존재 잘 작동 하지 않습니다. 젤 보라색 배경 얻습니다, 경우 다른 젤 준비는 것이 좋습니다 및 빛의 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품, Fondo 나시오날 드 개발 Científico y Tecnológico (Fondecyt), 칠레, 프로젝트 11130263 (CW)에, NERC 프로젝트 CONICYT + 프로그램이 드에 의해 지원 되었다 (CW)에 Colaboración 국제 PCI-PII20150073 및 Vicerrectoría de에서 U-inicia Investigación 대학 데 칠레 (CW)입니다.

Ciencias Químicas y를 박사 호르헤 Babul 그리고 디에고 Quiroga-로저 유용한 토론, 원고 및 주소 드 extensión 드 라 Facultad 드 수정에 대 한 로버트 Lesch에 대 한이 프로젝트의 초기 단계에 있는 도움에 대 한 타 호텔 팔 마에 감사 합니다. 칠레 대학에서에서 Farmacéuticas입니다. 마르셀 페 레 스는 비디오 편집을 제공 하는 음성-텍스트 및에 롤 왓슨 해결을 위한 닐 스티븐 스 너무 감사.

Materials

Nitro blue tetrazolium Gold Biotechnology 298-83-9 reagent used in the staining
SYBR Green I 10000X Thermo-Fisher S7563 reagent used in the staining
Gel extraction kit QIAGEN 28704 used to extract plasmid from the gel in integrity assay
DNA ladder Thermo-Fisher SM 1331 used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay
Agar Agar Merck used to make LB-ampicillin culture plates 
sodium chloride Merck 1064045000 used to make LB-ampicillin culture plates 
yeast extract Becton, Dickinson and Company 212750 used to make LB-ampicillin culture plates 
peptone Merck 72161000 used to make LB-ampicillin culture plates 
TEMED AMRESCO 761 used to make polyacrylamide gels
ammonium persulfate Calbiochem 2310 used to make polyacrylamide gels
acrylamide invitrogen 15512-023 used to make polyacrylamide gels
bisacrylamide SIGMA 146072 used to make polyacrylamide gels
Tris-base Merck 1083821000 used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
EDTA J.T. Baker 8993-01 used to make TAE buffer
Acetic acid Merck 1,000,632,500 used to make TAE buffer
agarose Merck 16802 used to make TAE buffer
spectrophotometer Tecan infinite 200 pro used to quantify DNA plasmid
water purificatiom unit Merck Elix 100 use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions
distilled water used in gels, culture medium, stainings and general solutions
HCl J.T. Baker 9535-03 used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
6X DNA loading dye Thermo-Fisher R0610
5 mm Blue LED Jinyuan electronics SP-021 light source used in integrity assay
protoboard KANDH KH102 light source support and circuit 
9 V battery Duracell used to power the LED's
horizontal electrophoresis chamber Biorad 1704486EDU used to make and run agarose gel in integrity assay
vertical electrophoresis kit Biorad 1658002EDU used to run polyacrylamide gels in calibration curves
power supply Biorad 1645050  used to power the electrophoresis

References

  1. LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
  2. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
  3. Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
  4. Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
  5. Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
  6. Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
  7. Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
  8. Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
  9. Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
  10. Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
  11. Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
  12. Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
  13. Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
  14. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
  15. Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
  16. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  17. Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
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Cite This Article
Paredes, A. J., Alfaro-Valdés, H. M., Wilson, C. A. DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure. J. Vis. Exp. (131), e56528, doi:10.3791/56528 (2018).

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