ADN coloration méthode basée sur la précipitation de Formazan induite par l’exposition à la lumière bleue
Summary
Cette méthode permet la coloration sélective et quantification de l’ADN en gels en trempant le gel dans un SYBR Green I / Nitro tétrazolium bleu solution et puis exposer au soleil ou une source de lumière bleue. Cela produit un précipité visible et ne nécessite presque aucun équipement, ce qui est idéal pour utilisation sur le terrain.
Abstract
Méthodes de coloration de l’ADN sont très importants pour la recherche biomédicale. Nous avons conçu une méthode simple qui permet la visualisation de l’ADN à le œil nu par la formation d’un précipité de couleur. Il fonctionne en trempant l’acrylamide ou de gel agarose de l’ADN dans une solution de 1 x (équivalent à 2,0 µM) SYBR Green I (SG j’ai) et 0,20 mM nitrobleu de tétrazolium qui produit un violet précipiter de formazan lorsqu’ils sont exposés aux rayons du soleil ou plus précisément la lumière bleue. Aussi, récupération des tests ADN ont été effectuées en utilisant un plasmide ampicillin résistant dans un gel teinté avec notre méthode. Un plus grand nombre de colonies a été obtenu avec notre méthode qu’avec la traditionnelle coloration à l’aide de SG j’ai avec éclairage ultraviolet. La méthode décrite est rapide, précis et non toxique pour la détection de l’ADN, ce qui permet la visualisation des biomolécules à « l’oeil nu » sans un Transilluminateur et est peu coûteux et approprié pour l’utilisation sur le terrain. Pour ces raisons, notre ADN nouvelle coloration méthode a ses avantages potentiels pour la recherche et l’industrie.
Introduction
Avec les progrès de la biochimie et de biologie moléculaire, les études portant sur l’ADN ont exigé des meilleures techniques pour analyser l’ADN. La première méthode pour la coloration de l’ADN a été de coloration, qui est très sensible mais manque de sélectivité à l’argent et ne permet pas la récupération de l’échantillon. Plus tard, le développement de coloration fluorescente d’ADN a permis la quantification sélective de l’ADN avec la possibilité de récupération de l’échantillon. L’un des colorants fluorescents premières utilisées pour la quantification de l’ADN de bromure d’éthidium1, ce qui est mutagène2. Cependant, maintenant il y a des colorants fluorescents améliorés plus sécuritaires et plus sensibles, tels que GelRed et SYBR Green I (SG je)3; mais tous ces colorants fluorescents nécessitent l’utilisation d’un Transilluminateur UV de (UV) ou d’un fluorimètre.
Il existe des autres techniques de coloration visiblement ADN, tels que le bleu de méthylène4 et cristal violet5,6,7,8,9, mais tous d’entre eux souffrent de sensibilité réduite et sélectivité. Les sels de tétrazolium sont sensibles à la réduction des composés organiques et lorsque cela se produit, ils forment un insoluble et coloré de formazan précipiter10,11. Récemment, certains sels de tétrazolium bivalents ont démontré à lier à l’ADN en raison de leurs anneaux de tétrazolium positive12.
Dans une récente publication13a proposé une nouvelle technique visible pour souiller et de quantifier l’ADN en gels de polyacrylamide, en utilisant la réduction d’un sel de tétrazolium bivalent appelé nitrobleu de tétrazolium (NBT) et des colorants fluorescents comme le bromure d’éthidium, GelRed, SYBR Green I et SYBR Gold. Cette réaction a travaillé en présence de lumière bleue ou la lumière du soleil et a permis la récupération de l’échantillon en améliorant la qualité par rapport à l’usage du SG j’ai avec un Transilluminateur UV. L’objectif du présent document est de fournir un protocole détaillé de la technique de coloration à l’aide de tétrazolium sels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un sensible et un roman basé sur l’ADN, méthode de coloration sur la réduction de NBT et l’utilisation de SG j’ai présenté dans cet article. L’étape critique dans le présent protocole est le temps d’incubation du gel dans le NBT-SG j’ai solution et la concentration de NBT. Le temps de coloration pour les gels d’agarose est plus long que pour les gels d’acrylamide en raison de la plus grande épaisseur de gels d’agarose. Cette méthode ne fonctionne pas bien en présence de SDS comme NBT précipit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par Fondo Nacional de Desarrollo y Científico Tecnológico (Fondecyt), Chili, 11130263 de projet (à la CW), projet CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (pour CW) et U-inicia depuis le Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (à CW).
Merci à Tatiana Naranjo-Palma de Majorque pour l’aider dans la phase initiale de ce projet, le Dr Jorge Babul et Diego Quiroga-Roger de discussion utile, Robert Lesch pour réviser le manuscrit et la Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de Universidad de Chile. Merci aussi à Pérez de Marcelo pour éditer la vidéo et Neil Stevens pour corriger le texte et Errol Watson pour la fourniture de la voix-off.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
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