الحمض النووي تلطيخ الأسلوب استناداً إلى هطول الأمطار Formazan الناجمة عن التعرض للضوء الأزرق
Summary
يسمح هذا الأسلوب تلطيخ انتقائية والتقدير الكمي للدنا في المواد الهلامية بامتصاص الجل في “أخضر سيبر” أنا/الحل “نيترو تيترازوليوم الأزرق” وثم يعرضها لأشعة الشمس أو مصدر ضوء أزرق. وهذا ينتج من ترسبات مرئية وتتطلب تقريبا أي معدات، مما يجعله مثاليا للاستخدام الميداني.
Abstract
أساليب المصبوغة الحمض النووي مهمة جداً للبحوث الطبية الحيوية. لقد قمنا بتصميم أسلوب بسيط يسمح التصور الحمض النووي للعين المجردة بتشكيل ترسبات الملونة. أنه يعمل من خلال نقع الاكريلاميد أو الحمض النووي [اغروس] هلام في حل من 1 x (أي ما يعادل 2، 0 ميكرومتر) الأخضر سيبر أنا (SG أنا) و 0.20 ملم نيترو الأزرق تيترازوليوم التي تنتج أرجواني يعجل من فورمازان عند التعرض لأشعة الشمس أو الضوء الأزرق على وجه التحديد. أيضا، أجريت اختبارات الحمض النووي لاسترداد باستخدام بلازميد مقاومة الأمبيسلّين في [اغروس] هلام ملطخة باسلوبنا. تم الحصول على عدد أكبر من المستعمرات باسلوبنا من تقليدية تلطيخ استخدام SG أنا مع إضاءة الأشعة فوق البنفسجية. وصف طريقة سريعة ومحددة، وغير سامة للكشف عن الحمض النووي، مما يسمح التصور الجزيئات الحيوية إلى “العين المجردة” دون ترانسيلوميناتور، وغير مكلفة وملائمة للاستخدام الميداني. ولهذه الأسباب، قد الحمض جديدة تلوين الأسلوب الفوائد المحتملة للبحوث والصناعة.
Introduction
مع التقدم في مجال الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، الدراسات المتعلقة بالحمض النووي قد يتطلب تقنيات أفضل لتحليل الحمض النووي. الطريقة الأولى لتلطيخ الحمض النووي الفضة تلطيخ، وهي حساسة للغاية ولكن تفتقر إلى الانتقائية ولا يسمح باسترداد عينة. في وقت لاحق، يسمح تطوير تلطيخ DNA الفلورسنت انتقائية التحديد الكمي للحمض النووي مع إمكانية استرداد عينة. كان أحد الأصباغ الفلورية الأولى المستخدمة لتقدير حجم الحمض النووي اثيديوم بروميد1، وهي مطفرة2. ومع ذلك، والآن هناك صبغات الفلورسنت المحسنة التي أكثر أماناً وأكثر حساسية، مثل جيلريد والأخضر سيبر أنا (SG أنا)3؛ ولكن كل هذه الأصباغ الفلورية تتطلب استخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) ترانسيلوميناتور أو فلوريميتير.
وهناك تقنيات أخرى لتلطيخ واضح الحمض النووي، مثل الميثيلين الأزرق4 والكريستال البنفسجي5،،من67،،من89، ولكن كل هذه تعاني من انخفاض حساسية و الانتقائية. أملاح تيترازوليوم مركبات عضوية قابلة للتخفيض، وعندما يحدث هذا فإنها تشكل غير قابلة للذوبان ويعجل formazan الملونة10،11. في الآونة الأخيرة، أظهرت بعض الأملاح tetrazolium الثنائي التكافؤ لربط الحمض النووي بسبب تلك الحلقات tetrazolium إيجابية12.
في منشور مؤخرا13، اقترح تقنية مرئية جديدة لوصمة عار وتحديدها كمياً الحمض النووي في الهلام بولياكريلاميدي، استخدام الحد من الملح tetrazolium الثنائي التكافؤ يسمى tetrazolium نيترو الأزرق (NBT)، والأصباغ الفلورية مثل اثيديوم بروميد، جيلريد، سيبر الأخضر الأول والذهب سيبر. رد الفعل هذا عملت بحضور الضوء الأزرق أو أشعة الشمس، ويسمح باسترداد عينة مع تحسين نوعية مقارنة باستعمال SG أنا مع ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية. والهدف من هذه الورقة هو تقديم بروتوكول مفصل لتقنية المصبوغة باستخدام تيترازوليوم الأملاح.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحساسة، ورواية استناداً الحمض النووي تلطيخ أسلوب الحد NBT واستخدام سان جرمان قد عرضت في هذا المقال. والخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي المرة الحضانة من الجل في NBT-سان جرمان أنا الحل وتركيز NBT. لقد حان وقت المصبوغة الجل [اغروس] أطول للمواد الهلامية الاكريلاميد بسبب زيادة سمك الهلام [اغروس]. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها فوندو ناسيونال de Desarrollo Científico y تكنولوجيا البحار (التمويلية)، شيلي، 11130263 المشروع (للأسلحة الكيميائية)، ومشروع اللجنة + الأدنى + دي Programa Colaboración انترناسيونال PCI-PII20150073 (للأسلحة الكيميائية) ويو-إينيسيا من دي Vicerrectoría بحوث جامعة شيلي (للأسلحة الكيميائية).
شكرا على تاتيانا نارانخو-بالما للمساعدة في المرحلة الأولى من هذا المشروع، الدكتور خورخي بابول وروجيه كيروغا دييغو للمناقشة مفيدة، وروبرت ليش لتنقيح المخطوط والمديرية de extensión de la كلية دي y Químicas العلوم العامة من جامعة شيلي. شكرا جداً لبيريز مارسيلو لتحرير الفيديو ونيل ستيفنز لتصحيح النص وواطسون إيرول لتوفير الإدخال الصوتي.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
