饱和脂肪酸诱导神经酰胺相关巨噬细胞死亡
Summary
本文阐述了一种从骨髓细胞中提取小鼠原发巨噬蛋白的方法, 并提出了制备 BSA-脂肪酸共轭物的简便方法。然后我们证明饱和脂肪酸能诱导巨噬细胞死亡, 这种细胞死亡与神经酰胺水平的细胞积累呈正相关。
Abstract
巨噬细胞高表达表皮脂肪酸结合蛋白和脂肪脂肪酸结合蛋白。他们积极摄取饱和和不饱和脂肪酸, 这可能在调节其免疫功能方面起到关键作用。许多研究表明, 各种脂肪酸, 饱和或不饱和, 可能对细胞生长和功能有不同的影响。然而, 用于脂肪酸制备的方法各不相同, 这可能导致 non-physiological 的结果。血清白蛋白是哺乳动物外周血中脂肪酸的天然载体, 推荐用脂肪酸钠盐组成共轭络合物, 研究哺乳动物细胞中的脂肪酸功能, 从而最大限度地减少脂肪酸皂的毒性。因此, 本文提出了一种简单、相对快速的加热和 sonicating 方法, 用于 BSA-脂肪酸共轭形成。我们描述了一个协议使用饱和脂肪酸, 特别是硬脂酸, 以诱导在小鼠骨髓衍生巨噬细胞死亡严重。我们进一步证明饱和脂肪酸诱导的细胞死亡与积累的细胞神经酰胺水平呈正相关。这种方法可以扩展到研究脂肪酸对其他哺乳动物细胞的影响。
Introduction
脂肪酸在能量代谢和不同类型细胞的膜磷脂合成中起着至关重要的作用。脂肪酸具有低水溶性。适当制备脂肪酸对研究哺乳动物细胞中脂肪酸的生物学功能具有重要意义。当脂肪酸准备用乙醇, 许多脂肪酸可能显示其有毒肥皂 (洗涤剂) 对细胞膜的影响, 即使在相对较低的浓度1。作为一个天然的, 主要运输者为游离脂肪酸在血清中, 血清白蛋白被认为是一个很好的载体脂肪酸传递在体外的脂肪酸功能检测2,3,4。然而, 尽管许多使用脂肪酸的研究论文已经出版, 但关于脂肪酸和血清白蛋白共轭物的制备的细节通常是不可用的。
巨噬细胞高表达表皮脂肪酸结合蛋白和脂肪脂肪酸结合蛋白5,6,7,8。他们积极摄取饱和和不饱和脂肪酸, 这可能调节他们的免疫功能。为了研究脂肪酸对巨噬细胞和其他组织的影响, 采用了不同的脂肪酸制备方法1,7,9。使用适当制备的脂肪酸/血清白蛋白结合物来研究脂肪酸对巨噬细胞功能的影响, 对于获得具有生物学意义的数据至关重要。研究脂肪酸对巨噬细胞功能的影响, 可为巨噬细胞相关疾病的脂肪酸代谢提供基础知识和潜在的治疗靶点。
Protocol
Representative Results
Discussion
正确制备脂肪酸溶液对研究脂肪酸的生物学功能具有重要意义。脂肪酸的中和性增加了其在水溶液中的溶解度。然而, 我们观察到, 脂肪酸的钠盐, 特别是饱和脂肪酸, 在水或 PBS 中的溶解度仍然很低。一种方法是使用 95-100% 乙醇来帮助溶解脂肪酸1。使用这种方法, 即使在较低浓度的低毒性不饱和脂肪酸, 对细胞的毒性也会更高。另一种制备脂肪酸溶液的方法是利用甲基β-环糊精作?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由路易斯维尔大学启动基金和国立癌症研究所 (R01CA177679, R01CA180986) 资助。
Materials
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
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