Questo articolo descrive i protocolli sperimentali per lo Studio ex vivo contrazioni del miometrio umano e la loro applicazione nella scoperta della droga. Questa tecnica è utilizzata per migliorare la comprensione delle myometrial fisiologia e patofisiologia pure quanto a convalidare dati farmacologici da romanzo ricerca sonde o droga conduce.
Individuazione e caratterizzazione di nuovi composti farmaceutici o biochimici sonde si basano su sistemi di dosaggio robusto e fisiologicamente rilevanti. Descriviamo i metodi per misurare la contrattilità del miometrio ex vivo . Questo test può essere utilizzato per studiare i fattori e molecole coinvolte nella modulazione della contrazione miometriale e per determinare le loro azioni eccitatori o inibitori e quindi loro potenziale terapeutico in vivo. Le biopsie sono ottenute dalle donne che subiscono la consegna cesarean sezione con consenso informato. Bene strisce di miometrio sono dissecati, ritagliati e collegati ad un trasduttore di forza all’interno di bagni dell’organo 1ml superfusi con soluzione fisiologica a 37 ° C. Strisce di sviluppare le contrazioni spontanee all’interno di 2 – 3 h sotto tensione impostata e rimangono stabili per molte ore (> 6 h). Strisce possono anche essere stimolate a contratto come dagli ormoni endogeni, ossitocina e vasopressina, che causano la modulazione della concentrazione-dipendente della frequenza di contrazione, forza e durata, che più assomigliano molto alle contrazioni in travaglio. Quindi, l’effetto di farmaci noti e romanzo può essere testato su contrazioni spontanee ed indotta da agonista.
Questo protocollo specificamente i dettagli come questo test può essere utilizzato per determinare la potenza degli agenti noti e romanzo misurando i loro effetti su vari parametri di contrazione miometriale umano. Usiamo l’ossitocina – e antagonisti dei recettori a V1a , atosiban e SR49059 come esempi di composti noti inibiscono le contrazioni indotte da ossitocina e vasopressina, che dimostrano come questo metodo può essere utilizzato per integrare e convalidare dati farmacologici ottenuti da analisi cell-based per aiutare lo sviluppo di farmaci. Gli effetti di nuovi agonisti in confronto di ossitocina e vasopressina possono anche essere caratterizzati. Mentre si usa l’esempio di ossitocina / sistema di vasopressina, questo metodo può anche essere usato per studiare altri recettori e canali ionici che svolgono un ruolo nella contrazione uterina e relax per far progredire la comprensione della fisiologia umana uterina e della patofisiologia.
L’obiettivo del drug discovery è di produrre il romanzo, potente e altamente selettivi ligandi che generano una risposta terapeutica attivando o inibendo le vie di segnalazione cellulare. Questo richiede un sistema di dosaggio appropriato in cui testare composti di piombo con risultati affidabili, robusti e rilevanti1. Tecniche farmacologiche come legame ligando-recettore e saggi funzionali spesso impiegano sistemi basati su cellule eterologhi, progettati per recettori iperesprimere che altrimenti non sarebbero presenti2. Mentre queste tecniche forniscono informazioni preziose per recettori farmacologia e lo sviluppo precoce di farmaci, i dati ottenuti potrebbero non riflettere uno scenario vero e proprio nel vivo . È quindi importante che dati farmacologici da analisi cell-based vengono convalidati anche nei modelli fisiologicamente rilevanti.
Muscolatura liscia uterina (miometrio) costituisce lo strato muscolare dell’utero che è responsabile per le contrazioni durante il travaglio che cancellare e dilatano la cervice e consegnare il feto3. Contrazione del miometrio è spontanea; non richiede input ormonale o nervoso per contratto4. Le contrazioni sono provocate da spontanea depolarizzazione della membrana cellulare myometrial che conduce all’apertura di operati di tensione Ca2 +-canali (canali di tipo L) e l’afflusso di Ca2 + nel cellulare5. Complessi di calcio con calmodulina e attiva la chinasi della catena leggera della miosina che a sua volta fosforila miosina permettendo di attraversare ponte ciclo di formazione con l’actina e la contrazione. Relax in genere è mediata da-fosforilazione della miosina di miosina fosfatasi e una riduzione della concentrazione di Ca2 + tramite sua estrusione da cella e/o sequestrante nel reticolo sarcoplasmatico (SR)5,6 ,7.
Diversi metodi sono stati sviluppati per studiare myometrial funzione e disfunzione, da interni ed esterni in vivo tocography e cateteri pressione intrauterina, alla generazione di cellule trasformate o immortalizzate di origine myometrial8 ,9,10,11,12. Mentre sistemi di colture cellulari in grado di rilevare se una sostanza può agire a livello cellulare, strisce di tessuti all’interno di bagni dell’organo possono essere utilizzati come strumenti per misurare le risposte funzionali dei tessuti tutta ai reagenti farmacologici. Il bagno tradizionale organo è in genere una camera grande vetro riscaldato che è in grado di tenuta tra 5 e 50 mL di soluzione fisiologica (PSS). Strisce all’interno di queste camere di ampie dimensioni richiedono normalmente aerazione con ossigeno e grandi volumi di PSS. Strisce di tessuto sono sezionati e sospeso all’interno della camera di balneazione e collegati ad un trasduttore di forza che misura le variazioni di tensione, come ad esempio durante una contrazione. Strisce di miometrio da umani e animali compresi, cavia13, mouse14, ratto15, coniglio16e gli altri17,18, sono stati utilizzati da un numero di gruppi di ricerca per esaminare molte domande relative alla myometrial fisiologia e patologia, tra cui lavori prematuri e disfunzionali. Ad esempio, myometrial strisce sono stati usati per identificare i fattori che regolano e modificare attività myogenic19,20,21, determinano organello funzione come il SR22, così come indagando modulatori dello ione canali23,24,26, pompe e scambiatori di25,27 per determinare il loro ruolo nella fisiologia myometrial.
Questa tecnica ex vivo permette per la valutazione delle performance di contrazione del tessuto e l’effetto diretto di diversi agenti sui parametri di contrazione deve essere misurata tra cui, forza di contrazione (resistenza), frequenza e durata, nonché la integrazione di questi valori, per generare un indice del lavoro totale svolto (forza media integrale o area sotto la curva, AUC). Come la preparazione di striscia di tessuto isolato costituisce un modello di più di un tipo di cellula, la risposta fisiologica del tessuto intero può essere misurata. La vasca di organo e la striscia di tessuto isolato sono pertanto uno strumento utile nel fornire il ponte tra il lavoro della coltura cellulare e animale intero /in vivo di lavoro. Quindi, nel campo della scoperta di farmaci, gli effetti di nuovi agenti in termini di loro eccitatori (cioè, stimolante) o inibitoria (cioè, rilassamento) potenziale in vivo può essere valutato più attentamente. Questa tecnica è stata utilizzata con successo nello sviluppo di ossitocina – e V1a-atosiban antagonista del recettore (OTR e V1aR) come agente tocolitico per inibire le contrazioni del travaglio pretermine e ritardare la nascita pretermine. Test in vitro di atosiban sulle strisce myometrial trovato l’antagonista in grado di ridurre significativamente l’ossitocina (OT)-indotto contrazioni28,29,30. Soprattutto questi studi ha contribuito a convalidare il valore traslazionale di atosiban e generati i dati di prova necessari per prendere in avanti a studi clinici31,32,33,34 . Atosiban ora è ampiamente usato come il farmaco di scelta per ritardare il lavoro in Europa. Studi di proof-of-concept simili sono stati effettuati per la carbetocina analogico di ossitocina mostrare il suo potenziale terapeutico nella prevenzione post-partum emorragia35,36,37. Altri composti di piombo in fase di sviluppo con questo test includono Langbeinite (GSK221149A)38 e nolasiban (dati non pubblicati). Questi metodi sono stati utilizzati con successo anche da confrontare tra gruppi di pazienti39,40,41,42,43,44, 45,46,47 ed esaminare le differenze intra-specie.
Qui descriviamo l’uso di strisce di tessuto isolato ex vivo da incinta miometrio umano all’interno di bagni su misura organo piccolo (1 mL) per illustrare come questo metodo può essere utilizzato per integrare e convalidare dati farmacologici ottenuti da analisi cell-based . Le biopsie sono state ottenute in gran parte da donne che subiscono la consegna Cesarean sezione (CS) elettiva pre-lavoro come sono ambulatorio previsto e quindi sono più facili da programmare insieme di biopsia, hanno facile accesso al myometrium, e tessuti non sono stati esposti a qualsiasi uterotonic stimolanti o rilassanti prima della chirurgia. Tuttavia, le biopsie si ottengono anche da donne che subiscono la consegna CS (emergenza) non pianificata in travaglio purché ci sia tempo sufficiente per consenso completamente il paziente. La maggior parte delle biopsie sono ottenute durante la chirurgia dal segmento uterino inferiore al sito di incisione chirurgica, tuttavia è anche possibile ottenere campioni dal segmento superiore48,49. In alcuni casi dopo il parto vaginale, le biopsie del punzone dal letto placenta sono state ottenute anche50. Tuttavia, questo non è il percorso più convenzionale e la quantità di tessuto myometrial estratto è piccola. Miometrio non-incinta possa essere ottenuto dalle donne pre- o post-menopausa che subisce l’isterectomia per circostanze ginecologiche benigne. Una biopsia di spessore completo è campionata post-patologia esame, dal corpus inferiore dalla cervice, e miometrio è preso dalla metà della parete uterina evitando le superfici serosal e dell’endometrio.
Mentre la maggior parte lo sviluppo di farmaci è inteso per il trattamento dei disordini umani, ricerca di base viene eseguita principalmente in tessuti animali. Qui, descriviamo i metodi per studiare ex vivo contrazioni del miometrio umano ottenuti da un intervento chirurgico che può essere utilizzato per affrontare una serie di importanti questioni correlate a uterina fisiologia e patologia, come pure per convalidare le risposte funzionali agli agenti farmacologici noti e romanzo per aiutare lo sviluppo di farmaci. In particolare, si evidenzia l’uso di questo test per studiare la risposta antagonistica di un noto OTR e V1aR antagonista competitivo, atosiban sulle contrazioni myometrial incinta OT-indotta, come pure da stabilire la risposta e il recettore selettività di un nuova concezione V1aR antagonista selettivo, [D-Arg8] INT. Dimostriamo che i parametri farmacocinetici importanti quali CE50 e IC50 possono essere calcolati, che allineare bene con i dati di farmacologia basata sulle celle.
Utilizzo simultaneo di più strisce permette per un confronto diretto di più effetti di agente, esperimenti di competizione con gli antagonisti e i relativi controlli di tempo e veicolo. I nastri sono spesso preparati in gruppi di 2, 4 o 8, questa tecnica fornisce un throughput moderato, le prove di composti di 2 – 4 a 6 – 8 (cumulative) concentrazioni (per biopsia). Questo metodo fornisce anche dati in tempo reale in modo che gli effetti possono essere valutati rapidamente e protocolli possono essere regolate. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per verificare qualsiasi composto di interesse ed è stata utilizzata con successo da un numero di gruppi di ricerca focalizzato sulla fisiologia myometrial e nella scoperta della droga. Oltre ad analizzare composti puri come descritto in questo documento, il modello di contrattilità uterina è stata anche e può essere utilizzato con successo per schermo per romanzo uterotonic composti da miscele, come preparazioni di erbe da medicina tradizionale7 , 55 , 56.
Anche se questo modello è tecnicamente robusto e Mostra buona riproducibilità, ha alcune limitazioni: dissezione può essere difficile per chi non ha dimestichezza con il tessuto o utilizzando attrezzature di dissezione, quindi nuovi utenti richiederà un certo tempo per ottimizzare il tessuto preparazione e protocolli. Si deve anche osservare che miometrio umano differisce da considerevolmente in apparenza ad altri modelli quali mouse e del ratto. Uteri di roditore la maggior parte sono composti da due corni uterini a forma di tubo, dotate di un’ovaia ad una estremità e si unì alla cervice. Ogni corno ha chiaramente definiti strati muscolari longitudinale e circolare, che possono essere facilmente separati alla dissezione, mentre i tipi di fibra differente nel miometrio umano spesso si intrecciano formando una ‘maglia’. Inoltre, i profili di contrazione del miometrio umano sono molto diversi per i roditori. In particolare, le contrazioni nel miometrio umano sono meno frequenti ma più lungo nella durata. Tempi sperimentali per l’utilizzo di miometrio umano pertanto sono spesso molto più lunghi rispetto ai modelli del roditore. Le differenze nell’espressione del recettore tra specie possono anche contribuire a abbastanza marcate differenze nelle risposte agli agonisti e questo dovrebbe essere tenuto in mente se estrapolando i risultati tra le specie.
Ci sono anche un numero di passaggi che devono considerazione per massimizzare l’output da questo sistema. Fasi critiche includono la conservazione della vitalità del tessuto come prendersi cura nella manipolazione di tessuti per evitare eventuali danni inutili durante la dissezione o durante il montaggio. Un occhio esperto è necessario sezionare belle strisce di muscolo uterino, assicurando che l’orientamento delle fibre muscolari è nella direzione longitudinale e seguendo il piano del tessuto, come pure evitando i tessuti cicatriziali, decidua e piccoli vasi. Per fini di orientamento di aiuto una volta che il campione è in laboratorio, è possibile aggiungere un tag (come piccolo punto chirurgico) al momento della raccolta a un lato della biopsia per delineare il bordo serosal dal bordo deciduale.
Tessuti dovrebbero essere tenuti a una costante 36 – 37 ° C durante la sperimentazione come funzione del tessuto è soggetto a variazioni termiche. Ciò può essere ottenuto con un robusto condizionatore d’aria all’interno del laboratorio. Aspersione costante di PSS riscaldato assicura che la temperatura viene mantenuta così come le vampate di calore fuori prodotti di scarto da contrazione. Temperatura all’interno dei bagni dell’organo può essere modificato cambiando la portata o regolando la temperatura del bagno di acqua direttamente. La dimensione di piccola vasca rispetto ai bagni tradizionali 5-50 mL garantisce un relativamente rapido avvicendamento del PSS e l’interruzione dei reagenti. Il bagno di organo miniaturizzati come descritto qui, riduce anche il volume di PSS e reagenti di interesse necessario, riducendo così al minimo i costi e risparmiando prezioso, di recente sviluppato prodotti chimici. Inoltre, a causa delle dimensioni di piccola vasca e utilizzando un tampone HEPES-basato, questo sistema non richiede ossigenazione per esempio, dalla bollitura PSS con carbogen. È importante anche la normalizzazione della tensione applicata alle strisce. Per le strisce di queste dimensioni (5 x 2 x 1 mm), questo dovrebbe essere circa 2 mN (equivalente a ~0.2 g). Metodi alternativi includono l’applicazione di una soluzione di potassio per indurre la contrazione massima e che si estende a metà di questa contrazione massima. Deve essere notato tuttavia, che tensione applicata in vivo possono differire.
Le sfide principali comprendono l’ottenimento di tessuti da soggetti umani, ma anche se faticoso, tessuti umani chiaramente rappresentano il più fisiologicamente rilevante (e gratificante) modello per lo studio della contrazione uterina nella scoperta di droga e la malattia umana. Il tessuto isolato strisce tuttavia, non corrispondono necessariamente a tessuto in vivo come sono esenti per esempio, di ormonale e nervoso in ingresso che, anche se non essenziale per la contrazione, modulerà contrazioni in vivo. Questo test fornisce tuttavia la possibilità di analizzare le contrazioni miometriale in maniera controllata, separata da tali influenze. Permette anche per l’effetto di fattori quali il controllo ormonale di contrazione (ad es., tramite OT, VP, prostaglandine, ecc.) di essere indagati, fornendo indizi per la regolazione della funzione myometrial. Come sono i tessuti ottenuti da donne diverse, c’è naturalmente qualche variazione nei profili contrattili spontanei tra esemplari. Quindi spesso è necessario eseguire esperimenti su un numero elevato (~ n = 10) di campioni per minimizzare la variazione in alcuni DataSet53. Questo è più importante quando si confrontano l’attività contrattile tra diversi gruppi di pazienti. La risposta di agonisti e antagonisti per controllare attività di normalizzazione (cioè, esprimendo in percentuale di attività di controllo o alta K+) riduce alcuni di questa variazione. Inoltre, per ridurre la variazione inter-striscia, dati possono essere normalizzati per area della sezione trasversale della striscia misurando la loro lunghezza e peso post sperimentazione41. Questo è particolarmente utile quando si confrontano i modelli di contrazione tra diversi gruppi di pazienti.
Limitazioni di questa tecnica includono anche l’accesso a tessuti freschi che richiede buone relazioni di lavoro con personale ospedaliero, soprattutto personale del teatro e coloro che sono coinvolti nel processo di consenso. Autorizzazioni etiche dal comitato di revisione comitato etico di ricerca e l’Istituto o ospedale locale anche bisogno di essere a posto. Raccolta di miometrio umano è probabilmente eseguita durante la consegna di CS, quando il donatore è in fase di intervento chirurgico. La biopsia è presa dallo stesso sito di incisione uterina fatto per la consegna del bambino e quindi il paziente non ha bisogno di sottoporsi a qualsiasi ulteriore ulteriori procedure. Personale di teatro e il chirurgo esegue la biopsia hanno bisogno di essere a conoscenza dell’uso successivo dei tessuti e che non devono essere posizionate in soluzioni fissativi ad per quanto riguarda l’invio di un reparto di patologia. Il lasso di tempo lungo sperimentale è un’altra considerazione. Esperimenti con i tessuti umani richiedere molte ore (in genere > 6h) (al contrario di 2 – 3 h per un esperimento simile in utero del ratto o topo), a causa della frequenza più lenta di contrazione e il tempo di ritardo di 2 – 3 h tra tessuto montaggio e istituzione di spontanea contrazioni. Tuttavia, come abbiamo mostrato, contrazioni di tessuto umano sono robuste e quando stabilito può contrarre per molte ore senza notevole affaticamento40.
Questo sistema permette anche altre sfide del lavoro in vivo da superare tra cui la possibilità di testare reagenti farmaceutici sul tessuto incinto. Questa tecnica può essere facilmente estrapolata ad altre specie tra cui mouse per cui i risultati iniziali possono essere confermati prima di procedere ulteriormente in studi animali intero. Cambi controllati in temperatura, composizione del superfusate (PSS) e pH può essere fatto facilmente per simulare diversi scenari in vivo e analizzare l’effetto di queste modifiche il comportamento composto. I principi fondamentali della tensione isometrica in myometrial strisce di misurazione possono essere espanso per misurare i cambiamenti simultanei nella concentrazione di calcio intracellulare o pH mediante l’uso di Ca fluorescente o indicatori di pH (H+) e attrezzatura per rilevare e registrare la fluorescenza57,58,59,60.
Nel complesso, il miometrio umano rappresenta un modello robusto e fisiologicamente rilevante per caratterizzare e convalidare nuovi composti terapeutici nella scoperta della droga — sia composti puri e miscele. Abbiamo fornito esempi del suo utilizzo nella scoperta della droga rispetto al sistema di OT/VP e focalizzata suunaR antagonisti OTR e V1 per mostrare come questo modello può essere utilizzato per determinare l’efficacia di composto e potenza a obiettivi definiti e convalidare selettività ligando. Tuttavia, e ‘ da tener presente che questa tecnica può essere utilizzato per studiare qualsiasi destinazione di interesse o il percorso che porta a contrazione miometriale (o relax), nonché per facilitare la scoperta di nuovi farmaci di nuovi obiettivi e percorsi e avanzare la nostra comprensione di myometrial fisiologia e patofisiologia.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta dal fondo austriaco di scienza (FWF) attraverso il progetto I3243 e del Consiglio europeo della ricerca (CER) nell’ambito Horizon 2020 ricerca dell’Unione europea e programma per l’innovazione (sovvenzione No 714366). CWG è stata sostenuta da un Fellowship di futuro di Australian Research Council (ARC) (FT140100730) e MM da un Fellowship di ARC scoperta precoce carriera ricercatore (DECRA) (DE150100784). SA è supportato da un Harris-benessere pretermine nascita Research Centre Grant amministrato dal benessere delle donne, UK.
Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
HBSS | SIGMA | H9269 | |
Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
[Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |