Este artículo describe los protocolos experimentales para el estudio ex vivo las contracciones del miometrio humano y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos. Esta técnica se utiliza para mejorar la comprensión de la fisiología myometrial y Fisiopatología, así como a validar los datos farmacológicos de sondas nuevas investigaciones o drogas conduce.
Descubrimiento y caracterización de nuevos compuestos farmacéuticos o sondas bioquímicas dependen de sistemas de ensayo robusto y fisiológicamente relevante. Se describen métodos para medir la contractilidad del miometrio ex vivo . Este ensayo puede utilizarse para investigar factores y moléculas implicadas en la modulación de la contracción miometrial y a determinar sus acciones excitatorias o inhibitorias y por lo tanto su potencial terapéutico en vivo. Las biopsias se obtienen de las mujeres sometidas a cesárea con consentimiento informado. Tiras finas de miometrio son disecadas, recortadas y conectadas a un transductor de fuerza en baños de órgano 1 mL sobrefundidos con solución de suero fisiológico a 37 ° C. Desarrollar contracciones espontáneas dentro de 2-3 h bajo tensión set y permanecer estable durante muchas horas (> 6 h). Las tiras también pueden ser estimuladas a contratar como por las hormonas endógenas, la oxitocina y la vasopresina, que causan la modulación dependiente de la concentración de la frecuencia de contracción, fuerza y duración, más parecidos a las contracciones de parto. Por lo tanto, el efecto de drogas conocidos y nuevos conductores puede ser probado en las contracciones espontáneas e inducidas por agonistas.
Este protocolo detalla específicamente cómo se pueden utilizar este análisis para determinar la potencia de agentes conocidos y novedosos mediante la medición de sus efectos sobre diversos parámetros de la contracción miometrial humana. Usamos la oxitocina y V1a antagonistas de los receptores, atosiban y SR49059 como ejemplos de los compuestos conocidos que inhiben las contracciones inducidas por la oxitocina y la vasopresina y demuestran cómo este método puede utilizarse para complementar y validar datos farmacológicos obtenidos de ensayos celulares para facilitar el desarrollo de fármacos. También se pueden caracterizar los efectos de los agonistas novedosos en comparación con la oxitocina y la vasopresina. Mientras que utilizamos el ejemplo de la oxitocina sistema vasopresina, este método también puede ser utilizado para el estudio de otros receptores y canales iónicos que juegan un papel en la contracción uterina y la relajación para avanzar en la comprensión de la fisiología uterina humana y Fisiopatología.
El objetivo de descubrimiento de fármacos es producir novela, potente y ligandos altamente selectivos que generan una respuesta terapéutica por activación o inhibición de vías de señalización celulares. Esto requiere un sistema de ensayo apropiado en el que probar compuestos con resultados confiables, robustas y relevantes1. Técnicas farmacológicas como Unión ligando-receptor y ensayos funcionales a menudo emplean sistemas de basadas en células heterólogos, dirigidos a receptores sobrexpresan que de otra manera no sería presente2. Mientras que estas técnicas proporcionan información valiosa para la farmacología del receptor y desarrollo temprano de drogas, los datos obtenidos no pueden reflejar un escenario cierto en vivo . Por lo tanto es importante que datos farmacológicos de ensayos de célula también se validan en modelos fisiológicamente relevantes.
Uterina del músculo liso (miometrio) constituye la capa muscular del útero que es responsable de las contracciones durante el parto que borrar y dilatan el cuello uterino y entregan el feto3. Contracción del miometrio es espontánea; no requieren el aporte hormonal o nervioso a contrato4. Las contracciones son provocadas por la despolarización espontánea de la membrana de la célula miometrial que conduce a la apertura de voltaje funcionado Ca2 +-canales (tipo L) y el influjo de Ca2 + en la célula5. Complejos de calcio con la calmodulina y activa la quinasa de cadena ligera de miosina que a su vez fosforila la miosina que permite la formación de ciclo puente cruzado con actina y contracción. Relajación por lo general está mediada por la fosforilación de la miosina por miosina fosfatasa y una reducción en la concentración de Ca2 + por medio de la extrusión de la célula o el secuestro en el retículo sarcoplásmico (SR)5,6 ,7.
Varios métodos se han desarrollado para estudiar la función miometrial y la disfunción, de catéteres de presión intrauterina y en vivo tocography internas y externas a la generación de células transformadas o inmortalizadas de origen miometrial8 ,9,10,11,12. Mientras que los sistemas de cultivo celular pueden detectar si una sustancia puede actuar a nivel celular, las tiras de tejidos en baños de órgano pueden utilizarse como herramientas para medir respuestas funcionales de tejidos todo farmacológicas reactivos. El baño de órgano tradicional suele ser una cámara de cristal climatizada grande que es capaz de sostener entre 5 y 50 mL de suero fisiológico (PSS). Las tiras dentro de estas grandes cámaras normalmente requieren aireación con oxígeno y grandes volúmenes de PSS. Tiras de tejido disecadas y suspendidas dentro de la cámara de baño y conectadas a un transductor de fuerza que mide los cambios en la tensión, tales como durante una contracción. Tiras de miometrio de seres humanos y animales como, conejillo de Indias13, ratón14, rata15, conejo16y otros17,18, se han utilizado por un número de grupos de investigación para examinar muchas preguntas relativas a myometrial fisiología y patología, incluyendo labores prematuras y disfuncionales. Por ejemplo, tiras de myometrial se han utilizado para identificar los factores que regulan y modificar actividad miógena19,20,21, determinan la función de organelas como el SR22, así como investigación de moduladores de ion canales23,24,25,26, bombas e intercambiadores de27 para determinar su papel en la fisiología miometrial.
Esta técnica ex vivo permite la evaluación del rendimiento de la contracción del tejido y el efecto directo de los diferentes agentes sobre los parámetros de la contracción para medirse entre ellos, fuerza de contracción (fuerza), frecuencia y duración, así como integración de estos valores, para generar un índice del trabajo total realizado (fuerza media integral o área bajo la curva, AUC). Como la preparación de la tira de tejido aislado constituye un modelo de más de un tipo de célula, se puede medir la respuesta fisiológica del tejido entero. El baño de órgano y la tira de tejido aislado por lo tanto son una herramienta útil en la prestación del puente entre el trabajo de la cultura de célula y animal enteroen vivo trabajo. Por lo tanto, en el campo del descubrimiento de fármacos, los efectos de agentes novedosos en términos de su excitatorios (es decir, estimulante) o inhibitorio (es decir, relajación) potencial en vivo pueden ser evaluadas más de cerca. Esta técnica fue utilizada con éxito en el desarrollo de la oxitocina – V y1a-atosiban de antagonista del receptor (1aR de OTR y V) como agente tocolítico para inhibir las contracciones de parto prematuro y retrasar el parto prematuro. In vitro pruebas de atosiban en tiras myometrial encontraron el antagonista capaz de reducir significativamente la oxitocina (OT)-inducida por las contracciones28,29,30. Lo importante es que estos estudios ayudaron a validar el valor traslacional de atosiban y generaron los datos de prueba de concepto es necesario tomar hacia adelante ensayos clínicos31,32,33,34 . Atosiban ahora es ampliamente utilizado como el fármaco de elección para retrasar el trabajo en Europa. Se realizaron estudios similares de prueba de concepto para que la oxitocina carbetocina analógico mostrar su potencial terapéutico en la prevención de la hemorragia de postparto35,36,37. Otros compuestos de plomo actualmente en desarrollo con este análisis incluyen retosiban (GSK221149A)38 y nolasiban (datos no publicados). Estos métodos también se han utilizado con éxito para comparar entre grupos de pacientes39,40,41,42,43,44, 4546,de,47 y examinar las diferencias intra-especies.
Aquí describimos el uso de aislado ex vivo tiras de tejido del miometrio humano embarazada dentro de baños de pequeños (1 mL) por encargo del órgano para ilustrar cómo este método puede utilizarse para complementar y validar los datos farmacológicos obtenidos de ensayos de célula . Las biopsias fueron obtenidas en gran parte de las mujeres sometidas a parto electivo a cesárea (CS) la mano de obra como son cirugía prevista y por lo tanto son más fáciles de programar colección biopsia, tienen fácil acceso al miometrio y tejidos no han sido expuestos a uterotónico estimulantes o relajantes antes de la cirugía. Sin embargo, también pueden obtenerse biopsias de las mujeres que recibían no planificados (emergencia) entrega de CS en el trabajo siempre que haya tiempo suficiente para totalmente el consentimiento del paciente. La mayoría de las biopsias se obtienen durante la cirugía del segmento uterino inferior en el sitio de la incisión quirúrgica, sin embargo también es posible obtener muestras de los segmento superior48,49. En algunos casos después del parto vaginal, las biopsias del sacador de la cama placentaria también se han obtenido50. Sin embargo, esta no es la ruta más convencional y la cantidad de tejido miometrial obtenido es pequeña. Miometrio no embarazadas puede obtenerse en mujeres previas o posmenopáusicas sometidas a histerectomia para condiciones ginecológicas benignas. Una biopsia de grosor completo es muestreado examen de la patología, del corpus inferior del cuello uterino, y miometrio se toma desde el centro de la pared uterina evitando las superficies serosas y endometriales.
Mientras más desarrollo de fármacos está diseñado para el tratamiento de enfermedades humanas, la investigación más básica se realiza principalmente en los tejidos animales. Aquí, describimos los métodos para investigar ex vivo las contracciones del miometrio humano Obtenido de la cirugía que se puede utilizar para tratar una serie de preguntas importantes relacionados con uterino fisiología y patología, así como para validar las respuestas funcionales a conocidos y nuevos agentes farmacológicos para ayudar el desarrollo de fármacos. En particular, destacamos el uso de este ensayo para investigar la respuesta antagónica de un conocido OTR y V1aR antagonista competitivo, atosiban en contracciones myometrial embarazada OT-inducida, así como determinar la respuesta y el receptor selectividad de un desarrollado recientemente V1aR antagonista selectivo, [D-Arg8] INT. Demostramos que pueden calcularse los parámetros farmacocinéticos importantes como IC50 EC50 , que se alinean bien con los datos de Farmacología celular.
Con múltiples tiras al mismo tiempo permite la comparación directa de múltiples efectos de agente, experimentos de competencia con los antagonistas y los controles adecuados de tiempo y el vehículo. Como las tiras están preparadas a menudo en grupos de 2, 4 o 8, esta técnica proporciona un rendimiento moderado, permitiendo la prueba de compuestos de 2 – 4 6 – 8 (acumulativo) concentraciones (por biopsia). Este método también proporciona datos en tiempo real para que los efectos pueden valorarse rápidamente y protocolos pueden ser ajustados. Además, esta técnica puede usarse para probar cualquier compuesto de interés y se ha utilizado con éxito por un número de grupos de investigación que se centró en fisiología miometrial y en descubrimiento de fármacos. Además de analizar compuestos puros como se describe en este documento, el modelo de contractilidad uterina también ha sido y puede ser utilizado con éxito para pantalla de uterotónicos novela compuestos de mezclas, tales como preparaciones herbarias de la medicina tradicional7 , 55 , 56.
Aunque este modelo es técnicamente sólido y muestra buena reproducibilidad, tienen algunas limitaciones: la disección puede ser difícil para quien no esté familiarizado con el tejido o use equipos de disección, por lo tanto nuevos usuarios requerirá algún tiempo para optimizar el tejido preparación y protocolos. Debe señalarse también que miometrio humano difiere considerablemente en apariencia a otros modelos como la rata y el ratón. Úteros de roedores la mayoría están compuestos por dos cuernos uterinos de forma de tubo, cada uno con un ovario en un extremo y Unido en el cuello uterino. Cada cuerno ha definido claramente las capas musculares longitudinal y circular, que pueden ser fácilmente separadas en la disección, mientras que los tipos de fibras diferentes en miometrio humano a menudo se entrelazan formando una ‘malla’. Además, los perfiles de la contracción del miometrio humano son muy diferentes a los roedores. En particular, las contracciones en el miometrio humano son menos frecuentes pero más duración. Marcos de tiempo experimentales para trabajar con miometrio humano por lo tanto son a menudo mucho más que modelos de roedores. Diferencias en la expresión del receptor entre especies también pueden contribuir a diferencias muy marcadas en las respuestas a los agonistas y esto debe tenerse en cuenta si la extrapolación de resultados a través de especies.
Hay también número de pasos que necesitan consideración para maximizar la salida de este sistema. Pasos críticos incluyen la preservación de la viabilidad del tejido como teniendo cuidado al manipular los tejidos para evitar cualquier daño innecesario durante la disección o al montaje. Un ojo experto es necesario diseccionar tiras finas del músculo uterino, garantizando que la orientación de las fibras musculares está en la dirección longitudinal y el plano del tejido, así como evitar los tejidos de la cicatriz, decidua y vasos pequeños. Para fines de orientación una vez que el espécimen en el laboratorio, es posible añadir una etiqueta (como pequeñas puntadas quirúrgicas) en el momento de recogida a un lado de la biopsia para delinear el borde serosal del borde decidual.
Los tejidos se deben mantener en un constante 36 – 37 ° C durante la experimentación como función del tejido está sujeto a las fluctuaciones de temperatura. Esto puede lograrse con una unidad de aire acondicionado robusto dentro del laboratorio. Perfusión constante de PSS caliente asegura que la temperatura se mantiene así como la descarga de productos de desecho de la contracción. Temperatura dentro de los baños de órgano puede modificarse cambiando la velocidad de flujo o ajustando la temperatura del baño de agua directamente. El tamaño de baño pequeño en comparación con los baños tradicionales 5-50 mL asegura una rotación relativamente rápida de PSS y lavado de los reactivos. El baño de órgano miniaturizados como se describe aquí, también reduce el volumen de PSS y reactivos de interés necesitada, minimizando así los costos y ahorrar preciosos, desarrollado recientemente productos químicos. Además, debido al tamaño del baño y usando un tampón HEPES base, este sistema no requiere oxigenación p. ej., por los burbujeantes PSS con carbogen. También es importante la normalización de la tensión aplicada a las tiras. Para las tiras de este tamaño (5 x 2 x 1 mm), esto debe ser aproximadamente 2 minutos (equivalente a ~0.2 g). Métodos alternativos incluyen la aplicación de una solución de alto potasio para inducir la contracción máxima y que se extiende hasta la mitad de esta contracción máxima. Debe ser observado sin embargo, esa tensión aplicada en vivo pueden diferir.
Los desafíos principales incluyen la obtención de tejidos de seres humanos, pero aunque gravar, tejidos humanos claramente representan lo más fisiológicamente relevante (y gratificante) modelo para el estudio de la contracción uterina en el descubrimiento humano de la enfermedad y de la droga. El tejido aislado tiras sin embargo, no necesariamente equivalen a tejido en vivo como por ejemplo, de hormonal y nervioso de entrada que, aunque no es esencial para la contracción, modula las contracciones en vivo. Este ensayo sin embargo brinda la oportunidad de analizar myometrial contracciones de forma controlada, separada de tales influencias. También permite el efecto de factores tales como el control hormonal de la contracción (por ejemplo, a través de OT, VP, prostaglandinas, etc.) para ser investigado, proporcionando claves para la regulación de la función miometrial. Ya que los tejidos se obtienen de diferentes mujeres, naturalmente hay alguna variación en los perfiles contráctiles espontáneos entre muestras. Por lo tanto, a menudo es necesario realizar experimentos en un gran número (~ n = 10) de muestras para reducir al mínimo la variación en algunos conjuntos de datos53. Esto es muy importante al comparar la actividad contráctil entre diferentes grupos de pacientes. Normalización de la respuesta de agonistas y antagonistas para el control de la actividad (es decir, expresar como un porcentaje de actividad de control o alta K+) reduce la parte de esta variación. Además, para reducir la variación inter-tira, datos pueden normalizarse para área seccional transversal midiendo su longitud y peso post experimentación41. Esto es particularmente útil cuando se comparan patrones de contracción entre los diferentes grupos de pacientes.
Limitaciones de esta técnica también incluyen acceso a tejidos frescos que requiere buenas relaciones de trabajo con personal del hospital, especialmente personal de teatro y los involucrados en el proceso de consentimiento. Permisos de éticos de la Junta de revisión de Comité de ética de investigación e Instituto u hospital local también necesitan estar en su lugar. Colección de miometrio humano es probablemente realizada durante la entrega de la CS, cuando el donante es sometidos a cirugía. La biopsia se toma del mismo sitio de la incisión uterina para entregar al bebé y por lo tanto el paciente no necesita someterse a algún procedimiento más adicional. Personal del teatro y el cirujano realizar la biopsia es necesario conocer el uso posterior de los tejidos y que no deben colocarse en soluciones de fijación tal como para enviar a un servicio de anatomía patológica. El plazo largo experimental es otra consideración. Experimentos con tejidos humanos tardan muchas horas (típicamente > 6 h) (a diferencia de 2-3 h para un experimento similar en útero de rata o ratón), debido a la frecuencia más lenta de la contracción y el tiempo 2-3 h entre montaje de tejidos y creación de espontánea contracciones. Sin embargo, como hemos demostrado, las contracciones del tejido humano son robustas y cuando puede contratar durante muchas horas sin cansancio significativo40.
Este sistema también permite otros retos de trabajo en vivo que superar incluyendo la posibilidad de probar farmacéuticos reactivos en tejido embarazado. Esta técnica puede extrapolarse fácilmente a otras especies como el ratón por el que se pueden confirmar resultados iniciales antes de proceder más lejos en los estudios en animales enteros. Cambios controlados en temperatura, composición de la superfusate (PSS) y el pH se puede hacer fácilmente para simular diferentes escenarios en vivo y analizar el efecto de estos cambios en el comportamiento del compuesto. Los principios básicos de medición de la tensión isométrica en tiras miometrial pueden ampliarse también a medir cambios simultáneos en la concentración de calcio intracelular o pH por el uso de fluorescente Ca o indicadores de pH (H+) y equipo para detectar y registro de la fluorescencia57,58,59,60.
En general, el miometrio humano representa un modelo robusto y fisiológicamente relevante caracterizar y validar nuevos compuestos terapéuticos en descubrimiento de fármacos, compuestos puros y mezclas. Hemos dado ejemplos de su uso en el descubrimiento de medicamentos con respecto al sistema de OT y Vicepresidente y se centró en OTR y V1unaR antagonistas para mostrar cómo este modelo puede utilizarse para determinar la eficacia compuesto y la potencia en objetivos definidos y validar la selectividad del ligando. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que esta técnica puede utilizarse para el estudio de cualquier objetivo de interés o camino que lleva a la contracción miometrial (o relajación), así como para facilitar el descubrimiento de medicamentos nuevos objetivos y caminos y avanzar en nuestra comprensión de myometrial Fisiología y Fisiopatología.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación ha sido apoyada por el fondo austriaco de ciencia (FWF) a través del proyecto I3243 y el Consejo Europeo de investigación (CEI) bajo programa de innovación e investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo Nº 714366 de la concesión). CWG ha sido apoyado por una beca del futuro del Consejo de investigación australiano (ARC) (FT140100730) y MM por una beca de arco descubrimiento precoz carrera investigador (DECRAN) (DE150100784). SA es apoyado por un bienestar de Harris prematuro nacimiento centro de beca de investigación administrado por bienestar de la mujer, UK.
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Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
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