Immobilisation Caenorhabditis elegans , à analyser le Transport intracellulaire dans les neurones
Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un bon modèle pour étudier le transport axonal et intracellulaire. Ici, je décris un protocole in vivo d’enregistrement et d’analyse du transport axonal et de chez c. elegans.
Abstract
Transport axonal et transport de (IFT) sont essentiels pour la fonction et morphogenèse axone et les cils. Dynéine et kinésine superfamille des protéines sont des moteurs moléculaires qui régulent antérograde et rétrograde transport, respectivement. Ces moteurs utilisent des réseaux de microtubules comme rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme modèle puissant pour étudier le transport axonal et IFT in vivo. Ici, je décris un protocole afin d’observer le transport axonal et IFT vie c. elegans. Marchandises transportées peut être visualisé par marquage des protéines de cargaison à l’aide de protéines fluorescentes comme protéine fluorescente verte (GFP). C. elegans est transparent et protéines GFP-étiquetée de cargaison peuvent être exprimés dans des cellules spécifiques en vertu de promoteurs spécifiques des cellules. Vers vivants peuvent être résolus en microbilles sur gel d’agarose 10 % sans tuer ou anesthésier les vers. Dans ces conditions, mouvement de la cargaison peut être directement observé dans les axones et les cils de la vie c. elegans sans dissection. Cette méthode peut être appliquée à l’observation de n’importe quelle molécule de fret dans toutes les cellules en modifiant les protéines cibles et/ou les ils sont exprimés dans les cellules. Les protéines plus basiques tels que les moteurs moléculaires et protéines d’adaptateur qui sont impliqués dans le transport axonal et IFT sont conservés chez c. elegans. Par rapport aux autres organismes modèles, mutants peuvent être obtenus et maintenus plus facilement chez c. elegans. La combinaison de cette méthode avec divers mutants de c. elegans peut clarifier les mécanismes moléculaires du transport axonal et IFT.
Introduction
L’imagerie de cellules vivantes est un outil essentiel pour l’analyse de transport intracellulaire. En biologie cellulaire neuronale, analyses du transport axonal avec l’imagerie de cellules vivantes sont essentielles pour comprendre la fonction et la morphogenèse neuronale1. Défauts dans le transport axonal sous-tendent plusieurs de troubles neurodégénératifs2. Kinésine superfamille des protéines et dynéine effectuer le transport axonal axonales et marqués, respectivement1,2.
Cils sont un autre compartiment cellulaire dans lequel le réseau de microtubules et traite des machines sont très développés3. Machinerie de synthèse de protéine n’est pas localisée dans les cils, ce qui signifie que les protéines ciliaires doivent être transportées du cytoplasme vers la pointe des cils. Kinésine propres cils et dynein, appelés kinésine-2 et cytoplasmiques dynéine-2, respectivement, transporter les composants de cils4, dans un phénomène appelé intraflagellaire transport (IFT)5. Dépréciation d’IFT provoque un éventail de maladies appelées ciliopathies6. Ainsi, l’analyse du mécanisme de l’imagerie de cellules vivantes IFT est nécessaire pour comprendre les mécanismes fondamentaux de la formation ciliaire et la pathogenèse.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un bon modèle pour étudier le transport axonal et IFT7,8,9. Pour observer l’IFT, Chlamydomonas a été largement utilisé comme un modèle organisme5,6. Comme Chlamydomonas est un organisme unicellulaire, la relation entre IFT et vieillissement, la fonction neuronale et comportement serait difficile à analyser. En outre, des techniques génétiques indispensables tels que CRISPR/Cas9 n’ont pas été appliquées de Chlamydomonas. Chez les organismes supérieurs de modèle, tels que souris et Drosophila, perturbation du transport axonal et IFT souvent provoque des phénotypes létales car transport axonal et IFT sont essentielles pour la morphogenèse et l’homéostasie des animaux 10, 11. Dans le cas de souris, transfection et culture cellulaire est généralement nécessaire d’observer le transport axonal et IFT, qui exige de nombreuses compétences et beaucoup de temps12,13. En outre, beaucoup de contexte physiologique important peut être perdue dans des cellules cultivées et des lignées cellulaires. Parce que le système nerveux n’est pas essentiel à la survie vers, c. elegans mutants dans lequel le transport axonal ou IFT sont perturbées ne sont souvent pas létales7,9,14. Le transport axonal et IFT peuvent être directement observé in vivo sans dissection parce que c. elegans est transparent et il est donc facile d’observer des marqueurs GFP-étiquetée.
Il existe plusieurs protocoles pour immobiliser c. elegans, comme l’utilisation d’un dispositif de microfluidique15, coussinets de gel d’agarose avec anesthésie16ou microbilles17. L’inclusion de l’anesthésie peut inhiber les événements trafic dans les neurones15. Un inconvénient évident de la méthode de dispositif microfluidique est que préparer un dispositif microfluidique n’est pas toujours facile. Au lieu de cela, immobilisation par coussinets de gel d’agarose et microbilles est un moyen pratique et facile d’effectuer l’imagerie de laps de temps chez c. elegans. Ici, je décris ce protocole de base pour immobiliser le c. elegans et visualiser le transport axonal et IFT in vivo dans c. elegans. Par rapport aux autres méthodes, la méthode décrite ici ne nécessite pas d’équipement spécial et est beaucoup moins cher et plus facile à réaliser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Limitation en ce qui concerne les méthodes existantes
La méthode décrite ici est optimisée afin d’observer les événements rapides tels que le transport axonal et IFT. Ainsi, immobilisation est plus prioritaire que d’incubation plus longue. Alors que nous avons pu observer les événements trafic pendant au moins 20 min sans perturbation significative, cette méthode peut ne pas convenir toujours d’observer les événements lentes nécessitant des observations plus longues, telles que l’a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’auteur remercie profondément Dr Asako Sugimoto (Université de Tohoku) pour son exposé utile. wyIs251 était un don généreux de m. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 a été fourni par la CCG, qui est financée par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Ce travail a été soutenu par la bourse JSPS KAKENHI #17 H 05010 et #16 H 06536 et Daiichi Sankyo foundation, Brain Science Foundation et la Fondation Naito.
Materials
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
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