Весь геном последовательности Candida glabrata для обнаружения маркеров противогрибковым препаратам
Summary
Это исследование реализован всего генома для анализа мутаций в генах, присвоении противогрибковым препаратам в Candida glabrata. C. glabrata изолятов устойчивых к echinocandins, азолов и 5-флуцитозин, были упорядочены для иллюстрации методологии. Восприимчивость профили изолятов, связаны с наличием или отсутствием структур конкретных мутаций в генах.
Abstract
Кандида glabrata можно быстро приобрести мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости, особенно для азолов и echinocandins. Определение генетических мутаций имеет важное значение, как сопротивление обнаруженные в vitro часто может быть соотнесена с клинической недостаточностью. Мы изучили возможность использования всего генома (РГ) для анализа генома общесистемной противогрибковым препаратам в C. glabrata. Цель была и создают условия и препятствия в осуществлении WGS и оценивать ее эффективность. В этом документе изложены основные качества контроля контрольно-пропускных пунктов и основных компонентов WGS методологии для изучения генетических маркеров, связанные с уменьшенной восприимчивости к противогрибковых препаратов. Она также оценивает точность анализа данных и поворот вокруг времени тестирования.
Фенотипические восприимчивость 12 клинических и один ATCC штамм C. glabrata был определен путем противогрибковые восприимчивость тестирования. Эти включены три изолировать пар, из трех пациентов, разработанные рост минимальный тормозной концентрации наркотиков. В две пары второй изолировать каждой пары разработан сопротивления echinocandins. Второй изолировать третьей пары развилась устойчивость к 5-флуцитозин. Оставшиеся состоит из восприимчивых и устойчивостью азол изолятов. Единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генов, связанных с echinocandin, азол и 5-флуцитозин сопротивления были подтверждены в устойчивые изолятов через WGS, с помощью следующего поколения последовательности. Non синоним ОНП в противогрибковые сопротивления, были определены гены как FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 и FCY2 . В целом, в среднем 98% говорится WGS изолятов C. glabrata , сопоставляются с геном ссылку с охватом около 75-fold чтения глубины. Сроки и стоимость, были сопоставимы с Сэнгер последовательности.
В заключение WGS C. glabrata было возможно в выявление мутаций гена клинически, участвующих в сопротивлении классов различных противогрибковый препарат без необходимости использования нескольких последовательности реакций ПЦР/ДНК. Это представляет собой позитивный шаг на пути к созданию WGS возможности в клинической лаборатории для одновременного обнаружения противогрибковые сопротивления присвоении замен.
Introduction
Кандида glabrata это все чаще встречающихся возбудителя с значение как вид, который проявляет устойчивость к азолов, а также совсем недавно,1,echinocandins,2,,3. В отличие от диплоидных C. albicansгаплоидным геномом C. glabrata может позволить ему приобрести мутации и более легко развить множественной лекарственной устойчивости. Совместное сопротивление для обоих классов наркотиков был также сообщили4. Таким образом ранние оценки противогрибковые восприимчивости и выявления лекарственной устойчивости в C. glabrata имеет решающее значение для правильного, целевые терапии в контексте противогрибковые руководством ограничить водителей антибиотикорезистентности1 , 5 , 6. Создание эффективного рабочего процесса быстро обнаружить наличие подтверждающих мутаций, связанных с Сопротивления биомаркеров в устойчивые изолятов будет также поможет улучшить предписывающих решениях и клинические исходы.
Противогрибковые восприимчивости обычно оценивается путем измерения минимальный тормозной концентрации (MIC), которая определяется как низкая концентрация препарата, что приводит к значительному сокращению темпов роста по сравнению с немедикаментозными роста микроорганизма управления. Клинические и лабораторные стандарты Института (CLSI) и Европейского комитета по тестирования по антимикробной чувствительности (EUCAST) имеют стандартизированные методы испытаний для определения MIC восприимчивости более точной и последовательной в7, 8. Однако утилита противогрибковые MIC остается ограниченным особенно для echinocandins, в частности отношении межлабораторных сравнений различных методологий и условия которых используются9. Существует также неопределенной корреляции с ответом на лечение echinocandin и неспособность отличить WT Мико (или подверженных) изоляты от тех, кто укрывает FKS мутации (echinocandin устойчивые штаммы)10,11. Несмотря на наличие подтверждающих сингл ген ГКДЗ и Сэнгер последовательности противогрибковые сопротивление, реализация результатов часто задерживается из-за отсутствия одновременного обнаружения нескольких сопротивления маркеры5,–12. Следовательно параллельных обнаружения сопротивления вручение мутаций в разных местах в геноме, включаемые на основе последовательности анализа всего генома, предлагает значительные преимущества в сравнении с текущими подходами.
Весь геном последовательности (РГ) успешно реализованы для отслеживания передачи болезни во время вспышек, а также подход для генома общесистемного риска оценки и наркотиков сопротивления, тестирование в13бактерий и вирусов. Последние достижения в технологии секвенирование нуклеиновой кислоты сделали всего генома (РГ) патогенов в клинически осуществимое поворот вокруг времени технически и экономически осуществимы. Секвенирования ДНК обеспечивает важные преимущества по сравнению с другими методами идентификации возбудителя и характеристика, занятых в микробиологии лаборатории14,,1516. Во-первых он обеспечивает универсальное решение с высокой пропускной способностью, скорость и качество. Последовательность может быть применен к любой из микроорганизмов и позволяет масштаба на местных или региональных лабораторий. Во-вторых он производит данные в формате «будущее» поддаются сравнения на национальном и международном уровнях. Наконец был увеличен потенциальной полезности WGS в медицине быстрый рост общественного данных баз, содержащих ссылку геномов, которые могут быть связаны с базы эквивалентных данных, которые содержат дополнительные метаданные клинических и эпидемиологических17 ,18.
Недавние исследования продемонстрировали полезность WGS для идентификации противогрибковые сопротивления маркеров из клинических изолятов Candida spp. 10 , 19 , 20. это главным образом объясняется наличие высокой пропускной способностью benchtop секвенсеры, установленным биоинформатики трубопроводов и снижается стоимость секвенирования21,22. Преимущество грибковых WGS Сэнгер, последовательности, что РГ позволяет секвенирования геномов несколько на один запуск. Кроме того РГ Candida геномов может идентифицировать новые мутации в наркотиков цели, отслеживать генетической эволюции и появление клинически значимых типов последовательности20,,2223. Самое главное в случае внутренней множественной лекарственной устойчивости, WGS может помочь раннего выявления мутаций присвоении сопротивления до лечения выбор22,24.
Здесь мы изучили возможности WGS-поддержкой скрининга для мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью к различным классам противогрибковых препаратов. Мы представляем методологии для осуществления WGS с точки зрения лабораторных диагностических микология и конечных пользователей. Мы включили в этот анализ, что три изолировать пар, культивированный из трех отдельных клинических случаев, в которых в vitro устойчивость к echinocandins и 5-флуцитозин разработаны со временем, после противогрибковое лечение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование определяет целесообразность, приблизительные сроки и точность обнаружения WGS-руководствуясь лекарственной устойчивости в C. glabrata. Время обработки (ТАТ) для подготовки библиотека и последовательности было четыре дня и отчетности проанализированы результаты одно?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана центра инфекционных заболеваний и микробиологии, общественного здравоохранения. Авторы не получили каких-либо других источников финансирования для этого исследования. Авторы благодарят Drs Alicia Арнотт, Натан Бахман и Ranjeeta Менон за их квалифицированную консультацию и помощь с весь геном последовательности эксперимент.
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
