Todo genoma secuencia del glabrata de la Candida para detección de marcadores de antihongos drogas resistencia
Summary
Este estudio implementa la secuenciación del genoma entero para el análisis de mutaciones en genes que confieren resistencia a los fármacos antifúngicos en Candida glabrata. Aislamientos de C. glabrata resistentes a equinocandinas, azoles y 5-flucitosina, se secuenciaron para ilustrar la metodología. Perfiles de susceptibilidad de los aislamientos correlacionados con la presencia o ausencia de patrones de la mutación específica de genes.
Abstract
Candida glabrata puede adquirir rápidamente las mutaciones que resultan en resistencia a los medicamentos, especialmente a azoles y equinocandinas. Identificación de mutaciones genéticas es esencial, como la resistencia detectada en vitro a menudo puede ser correlacionado con la falta clínica. Examinamos la viabilidad de utilizar la secuenciación del genoma entero (gt) para el análisis del genoma de resistencia a los fármacos antimicóticos en C. glabrata. El objetivo era torecognize facilitadores y barreras en la implementación WGS y medir su eficacia. Este documento describe los puntos clave de control de calidad y componentes esenciales de la metodología de grupos para investigar marcadores genéticos asociados con reducida susceptibilidad a antifúngicos. También estima la precisión de análisis de datos y vuelta alrededor de tiempo de prueba.
Susceptibilidad fenotípica de 12 clínicas y una cepa ATCC de C. glabrata se determinan mediante las pruebas de susceptibilidad antifúngica. Estos incluyeron tres aislar a pares de tres pacientes que desarrollaron aumento de concentraciones inhibitorias mínimas de drogas. En dos pares, aislar a la segunda de cada par desarrollado resistencia a las equinocandinas. El segundo aislante del tercer par desarrolló resistencia a 5-flucitosina. El restante compuesto por susceptibles y resistentes a azoles aislados. Polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en genes relacionados con resistencia equinocandina, azoles y 5-flucitosina fueron confirmados en aislantes resistentes a través de grupos usando la siguiente secuencia de generación. No-sinónimas SNPs en resistencia antifúngica se identificaron genes como FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 y FCY2 . General, un promedio de 98% de las lecturas WGS de aislamientos de C. glabrata trazados el genoma de referencia con cobertura sobre 75-fold profundidad leer. El tiempo de entrega y el coste eran comparables a Sanger secuenciación.
En conclusión, era factible en revelar mutaciones en el gen clínicamente significativos implicados en la resistencia a las clases diferentes antimicóticos sin la necesidad de múltiples reacciones de secuenciación de ADN PCR WGS de C. glabrata . Esto representa un paso positivo hacia el establecimiento de capacidad WGS en el laboratorio clínico para la detección simultánea de sustituciones que confiere resistencia a antifúngicos.
Introduction
Candida glabrata es un patógeno encontrado cada vez más importancia como una especie que exhibe resistencia a los azoles así como más recientemente, las equinocandinas1,2,3. A diferencia de los diploides de C. albicans, el genoma haploide de C. glabrata puede permitir adquirir mutaciones y desarrollan resistencia a múltiples drogas más fácilmente. La resistencia a ambas clases de drogas también ha sido reportado4. Por lo tanto, la evaluación temprana de antihongos de la susceptibilidad y la detección de resistencia a medicamentos en C. glabrata es cruciales para la terapia correcta y específica, así como en el contexto de corresponsabilidad antihongos para limitar los conductores de resistencia a los antimicrobianos1 , 5 , 6. establecer un flujo de trabajo eficiente para detectar rápidamente la presencia de confirmación mutaciones vinculadas a biomarcadores de resistencia en aislamientos resistentes será también ayuda a mejorar la prescripción de las decisiones y los resultados clínicos.
Antihongos de la susceptibilidad generalmente se evaluaron mediante la medición de la concentración inhibitoria mínima (MIC) que se define como la menor concentración de droga que resulta en una reducción significativa en el crecimiento de un microorganismo en comparación con la de un crecimiento libre de drogas control. La clínica e Instituto de normas de laboratorio (CLSI) y Comité Europeo en pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (EUCAST) han estandarizado métodos de prueba para determinación de MIC la susceptibilidad más precisa y consistente7, 8. Sin embargo, la utilidad de MIC antihongos sigue siendo limitada especialmente para las equinocandinas, en particular con respecto a las comparaciones entre laboratorios donde diferentes metodologías y las condiciones son usadas9. También existe correlación incierto de micrófonos con respuesta al tratamiento de la equinocandina e incapacidad de distinguir el peso (o susceptibles) aislados de aquellos que FKS mutaciones (cepas resistentes a la equinocandina)10,11. A pesar de la disponibilidad de confirmación PCR de gen único y Sanger secuenciación de los marcadores de resistencia a antimicóticos, realización de resultados se retrasa a menudo debido a la falta de detección simultánea de múltiples marcadores de resistencia5,12. Por lo tanto, la detección simultánea de mutaciones que confieren resistencia en diversas localizaciones en el genoma, de análisis basados en la secuenciación de todo el genoma, ofrece importantes ventajas sobre enfoques actuales.
Todo el genoma secuencia (WGS) se ha implementado con éxito para seguir la transmisión de la enfermedad durante los brotes, así como un enfoque para genoma riesgo evaluación y drogas prueba de resistencia en las bacterias y los virus13. Los avances recientes en tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos han hecho la secuenciación del genoma entero (gt) de patógenos en una vuelta alrededor de tiempo clínicamente útiles técnicamente y económicamente factible. Secuencia de la DNA ofrece importantes ventajas sobre otros métodos de identificación de patógenos y caracterización empleadas en laboratorios de Microbiología14,15,16. En primer lugar, proporciona una solución universal con calidad, rapidez y alto rendimiento. La secuencia puede ser aplicada a cualquiera de los microorganismos y permite economías de escala en laboratorios locales o regionales. En segundo lugar, produce datos en un formato de ‘futuro’ susceptible de comparación a nivel nacional e internacional. Finalmente, la utilidad potencial de gt en medicina ha sido aumentada por el rápido crecimiento de bases de datos públicas que contienen genomas de referencia, que pueden ser vinculadas a bases de datos equivalentes que contienen metadatos adicionales clínicos y epidemiológicos17 ,18.
Estudios recientes han demostrado la utilidad de gt para la identificación de marcadores de resistencia antifúngica de aislamientos clínicos de Candida spp. 10 , 19 , 20. esto se debe principalmente a la disponibilidad de secuenciadores de sobremesa de alto rendimiento, tuberías de Bioinformática establecidos y disminuir el costo de la secuenciación de21,22. La ventaja de WGS hongos sobre Sanger secuenciación es que WGS permite la secuenciación de genomas múltiples en una única prueba. Además, WGS de genomas de Candida pueden identificar mutaciones en las dianas farmacológicas, seguimiento de evolución genética y la aparición de tipos de secuencia clínicamente relevantes20,22,23. Lo más importante, en casos de multirresistencia intrínseca, WGS puede ayudar en la detección temprana de las mutaciones que confieren resistencia antes de tratamiento selección22,24.
Aquí, hemos examinado la viabilidad de WGS habilitada detección de mutaciones asociadas con resistencia a diferentes clases de agentes antimicóticos. Se presenta una metodología para la implementación de grupos desde la perspectiva del laboratorio de Micología diagnóstica y usuario final. Se incluyeron en este análisis tres aislar a pares cultivados de tres casos clínicos diferentes en que en vitro resistencia a las equinocandinas y 5-flucitosina se convirtió con el tiempo después del tratamiento antifúngico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio determinó viabilidad, plazos aproximados y precisión de guiado de WGS detección de resistencia de C. glabrata. El tiempo de respuesta (TAT) para la preparación de la biblioteca y la secuencia fue cuatro días e informe de los días de doblete de resultados analizados. Esto se compara con al menos una cantidad similar TAT para los ensayos de susceptibilidad de placas y Sanger secuenciación con un número significativamente mayor de muestras. Unos 30-90 C. glabrata genomas pueden ser sec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el centro para enfermedades infecciosas y microbiología, salud pública. Los autores no han recibido ningún otro financiamiento para este estudio. Los autores agradecen Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann y Ranjeeta Menon por su asesoramiento y ayuda con el experimento de secuenciación del genoma entero.
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
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