Ganze Genom-Sequenzierung von Candida Glabrata für Erkennung von Markierungen von Antimykotika Resistenz
Summary
Diese Studie implementiert kompletten Genoms für die Analyse von Mutationen in Genen konferieren antimykotische Resistenzen in Candida Glabrata. Resistent gegen Echinocandine, Azole und 5-Flucytosine, C. Glabrata Isolate wurden sequenziert, um die Methodik zu veranschaulichen. Profile der Anfälligkeit der Isolate korreliert mit Vorhandensein oder Fehlen von spezifischen Mutation Muster in den Genen.
Abstract
Candida Glabrata erwerben rasch Mutationen, die zu Resistenzen, vor allem Azole und Echinocandine führen. Identifizierung von genetischen Mutationen ist wichtig, da Widerstand erkannt, dass in-vitro- oft mit klinischen Versagen korreliert werden können. Wir untersuchten die Machbarkeit der Verwendung von kompletten Genoms (WGS) für genomweite Analyse von Antimykotika Resistenzen in C. Glabrata. Das Ziel war Torecognize Enabler und Hindernisse bei der Umsetzung WGS und seine Effektivität zu messen. Dieses Papier beschreibt die wichtigsten Qualitätskontrolle Checkpoints und wesentliche Bestandteile der WGS Methodik, genetische Marker, die mit verringerte Empfänglichkeit gegenüber Antimykotika zu untersuchen. Er schätzt auch die Genauigkeit der Datenanalyse und Zug-um-Zeit der Erprobung.
Phänotypische Anfälligkeit von 12 klinische und ein ATCC Stamm von C. Glabrata wurde durch antimykotische Empfindlichkeitsprüfungen ermittelt. Diese enthalten drei isolieren Paare aus drei Patienten, die Anstieg der Droge minimalen inhibitorischen Konzentration entwickelt. Zwei Paare die zweite jedes Paar entwickelt Resistenz gegen Echinocandine isolieren. Das zweite Isolat des dritten Paares entwickelt Resistenz gegen 5-Flucytosine. Die restlichen bestehend anfällig und Azole resistente Isolate. Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) in Verbindung mit Echinocandin, Azole und 5-Flucytosine Widerstand Gene wurden in resistenten Isolate durch WGS mit der nächsten Generation-Sequenzierung bestätigt. Non-Synonyme SNPs in antimykotische Widerstand Gene wie FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 und FCY2 wurden identifiziert. Alles in allem, durchschnittlich 98 % des WGS lautet C. Glabrata Isolate auf das Referenz-Genom mit ca. 75-fold lesen Sie Tiefe Abdeckung abgebildet. Die Turnaround-Zeit und die Kosten waren vergleichbar mit Sanger Sequenzierung.
Zusammenfassend war WGS von C. Glabrata möglich bei der Aufdeckung klinisch signifikanten Genmutationen, die Resistenz gegen verschiedene Antimykotika Medikamentenklassen ohne die Notwendigkeit für mehrere PCR/DNA Sequenzierung Reaktionen beteiligt. Dies ist einen positiven Schritt hin zu WGS Fähigkeit im klinischen Labor für simultane Detektion von Antimykotika Widerstand Verleihung Substitutionen.
Introduction
Candida Glabrata ist eine zunehmend auftretende Erreger mit Bedeutung als eine Art, der Widerstand der azole sowie in jüngerer Zeit, die Echinocandine1,2,3aufweist. Im Gegensatz zu den diploiden C. Albicanskönnen die haploide Genom von C. Glabrata Mutationen zu erwerben und entwickeln Multi-Resistenzen leichter. Co-Resistenz an beide Substanzklassen wurde auch berichtet,4. Daher ist frühzeitige Bewertung der pilzbefallverhütende Anfälligkeit und Erkennung von Resistenzen in C. Glabrata entscheidend für die richtige und gezielte Therapie sowie im Zusammenhang mit Antimykotika Treuhandschaft, Fahrer von Antibiotikaresistenzen1 zu begrenzen , 5 , 6. Gründung einen effizienten Workflow, schnell zu erkennen, das Vorhandensein von bestätigenden Mutationen verbunden mit Widerstand Biomarker in resistenten Isolate werden auch Entscheidungen zur Verbesserung der Verschreibung und klinische Ergebnisse.
Pilzbefallverhütende Anfälligkeit bemisst sich in der Regel durch die Messung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) definiert als die niedrigste Wirkstoffkonzentration, die Ergebnisse in einer signifikanten Reduktion Wachstum eines Mikroorganismus im Vergleich zu einem drogenfreien Wachstum Kontrolle. Klinische und Labor Standards Institute (CLSI) und European Committee auf antimikrobielle Empfindlichkeit Testing (EUCAST) haben standardisierte Anfälligkeit Prüfmethoden um MIC Bestimmung, präzise und konsistente7, 8. Bleibt jedoch das Dienstprogramm antimykotische MIC begrenzt, vor allem für die Echinocandine, insbesondere in Bezug auf laborübergreifenden Vergleiche wo sind unterschiedliche Methoden und Bedingungen verwendeten9. Es gibt auch unsicher Korrelation von Mikrofonen mit Reaktion auf Echinocandin Behandlung und Unfähigkeit WT zu unterscheiden (oder anfällig) Isolate von denen beherbergen FKS Mutationen (Echinocandin-resistente Stämme)10,11. Trotz der Verfügbarkeit von bestätigenden Single-gen PCRs und Sanger Sequenzierung von Antimykotika Antibiotikaresistenz-Markern, Realisierung der Ergebnisse ist oft verzögert aufgrund mangelnder simultane Detektion von mehreren Widerstand Markierungen5,12. Gleichzeitige Erfassung von Widerstand konferieren Mutationen an verschiedenen Orten im Genom, aktiviert durch die gesamte Genom-Sequenzierung basierende Analyse bietet somit erhebliche Vorteile gegenüber aktuellen Ansätzen.
Gesamte Genom-Sequenzierung (WGS) wurde erfolgreich umgesetzt, um die Übertragung von Krankheiten während der Ausbrüche als auch einen Ansatz zur genomweiten Risiko Bewertung und Resistenz in Bakterien und Viren13Tests zu verfolgen. Jüngste Fortschritte in der Technologie der Nukleinsäure-Sequenzierung unternommen des kompletten Genoms (WGS) von Krankheitserregern in einen klinisch verwertbare Zug-um-Time technisch und wirtschaftlich machbare. DNA-Sequenzierung bietet wichtige Vorteile gegenüber anderen Methoden der Erreger Identifizierung und Charakterisierung in Mikrobiologie Labors14,15,16beschäftigt. Erstens bietet es eine universelle Lösung mit hohem Durchsatz, Schnelligkeit und Qualität. Sequenzierung kann auf alle Mikroorganismen angewendet werden und ermöglicht Skaleneffekte auf lokaler oder regionaler Laboratorien. Zum anderen produziert sie Daten in einem “zukunftssicher” Format zugänglich Vergleich nationaler und internationaler Ebene. Schließlich hat der potenzielle Nutzen von WGS in der Medizin ergänzt durch das rasante Wachstum der öffentlichen Datenbanken mit Referenz Genome, die entsprechende Datenbanken verknüpft werden können, die zusätzliche klinische und epidemiologische Metadaten17 enthalten ,18.
Jüngsten Studien belegen den Nutzen der WGS zur Identifizierung von Antimykotika Antibiotikaresistenz-Markern von klinischen Isolaten von Candida Spp. 10 , 19 , 20. Dies ist vor allem aufgrund der Verfügbarkeit von Hochdurchsatz-Benchtop-Sequenzer, etablierten Bioinformatik Rohrleitungen und sinkenden Kosten der Sequenzierung21,22. Der Vorteil von Pilz WGS über Sanger-Sequenzierung ist, dass WGS Sequenzierung mehrere Genome auf einem einzigen Lauf ermöglicht. Darüber hinaus können WGS von Candida Genomen Roman Mutationen im Drogeziele zu identifizieren, verfolgen Sie genetische Entwicklung und Entstehung von klinisch relevanten Sequenztypen20,22,23. Im Falle einer intrinsischen multidrug-Resistenz helfen WGS vor allem bei der Früherkennung von Widerstand konferieren Mutationen vor Behandlung Auswahl22,24.
Hier untersuchten wir die Machbarkeit der WGS-fähigen Screening auf Mutationen im Zusammenhang mit Resistenzen auf verschiedene Klassen von Antimykotika. Wir präsentieren eine Methodik für die Durchführung der WGS von End-User und Diagnose Mykologie Labor Perspektiven. Wir enthalten in dieser Analyse, dass drei Paare aus drei separaten klinische Fälle in die in-vitro- Widerstand gegen die Echinocandine und 5-Flucytosine entwickelt im Laufe der Zeit nach antimykotische Behandlung kultiviert zu isolieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie stellte fest, Machbarkeit, ungefähre Timelines und Präzision der WGS-geführte Nachweis von Resistenzen in C. Glabrata. Die Bearbeitungszeit (TAT) für die Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung wurde vier Tage und Berichterstattung der analysierten Ergebnisse ein bis zwei Tage. Im Vergleich dazu mindestens einer ähnlichen Menge TAT für Anfälligkeit Assays von Kultur Teller und Sanger-Sequenzierung mit deutlich höheren Anzahl von Proben. Ca. 30-90 C. Glabrata Genome sequenziert wer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Zentrum für Infektionskrankheiten und Mikrobiologie, die öffentliche Gesundheit unterstützt. Die Autoren erhielten keine anderen Mittel für diese Studie nicht. Die Autoren danken Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann und Ranjeeta Menon für ihre kompetente Beratung und Unterstützung mit dem gesamten Genom-Sequenzierung-Experiment.
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
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