Hele genomet sekvensering av Candida glabrata for gjenkjenning av markører av soppdrepende resistens
Summary
Denne studien implementert hele genomet sekvenser for analyse av mutasjoner i gener overdragelse soppdrepende resistens i Candida glabrata. C. glabrata isolerer motstandsdyktig mot echinocandins, azoles og 5-flucytosine, ble rekkefølge for å illustrere metodikken. Mottakelighet profiler isolert korrelert med tilstedeværelse eller fravær av spesifikke mutasjonen mønstre i gener.
Abstract
Candida glabrata kan raskt skaffe mutasjoner som fører til resistens, spesielt til azoles og echinocandins. Identifikasjon av genetiske mutasjoner er viktig, som motstand oppdaget i vitro kan ofte være korrelert med klinisk svikt. Vi undersøkte muligheten for å bruke hele genomet sekvensering (WGS) for genomet hele analyse av soppdrepende resistens i C. glabrata. Målet var torecognize enablers og barrierer i gjennomføringen WGS og måle effektiviteten. Dette dokumentet beskriver viktige kvalitetskontroll kontrollpunkter og viktige komponenter i WGS metodikk undersøke genetiske markører knyttet til redusert mottakelighet for soppdrepende midler. Det anslår også nøyaktigheten av dataanalyse og turn-rundt-tid testing.
Fenotypiske mottakelighet av 12 kliniske og en ATCC stammen av C. glabrata identifiserte gjennom soppdrepende mottakelighet testing. Disse inkluderte tre isolere par, fra tre pasienter, som utviklet økning i narkotika minimum hemmende konsentrasjoner. I to par isolere andre av hver par utviklet motstand mot echinocandins. Den andre isolere av tredje par utviklet resistens mot 5-flucytosine. De resterende består av utsatt og azole motstandsdyktig isolater. Single nukleotid (SNPer) i gener knyttet til echinocandin, azole og 5-flucytosine ble bekreftet i motstandsdyktig isolerer gjennom WGS bruker den neste generasjons sekvensering. Ikke-synonymt SNPs i soppdrepende motstand gener som FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 og FCY2 ble identifisert. Samlet, gjennomsnittlig 98% av WGS leser av C. glabrata isolerer tilordnet referanse genomet med ca 75-fold Les dybde dekning. Den behandlingstid og kostnad var sammenlignes med Sanger sekvensering.
Avslutningsvis var WGS av C. glabrata mulig i avslørende klinisk signifikant genet mutasjoner i motstand mot ulike soppdrepende narkotika klasser uten behov for flere PCR/DNA sekvensering reaksjoner. Dette representerer et positivt skritt mot etablering WGS evne i kliniske laboratoriet samtidige deteksjon av soppdrepende motstand overdragelse erstatninger.
Introduction
Candida glabrata er en stadig fant patogen med betydning som en art som viser motstand til azoles og mer nylig, den echinocandins1,2,3. I motsetning til den diploide C. albicanskan haploid genomet av C. glabrata det å erverve mutasjoner og utvikle flere resistens lettere. Co motstand til begge narkotika klasser har også vært rapportert4. Derfor er tidlig evaluering av soppdrepende mottakelighet og påvisning av resistens i C. glabrata avgjørende for riktig, målrettet terapi i sammenheng med soppdrepende forvaltning å begrense drivere på resistensutvikling1 , 5 , 6. å etablere en effektiv arbeidsflyt raskt oppdage tilstedeværelsen av bekreftende mutasjoner knyttet til motstand biomarkers i motstandsdyktig isolerer vil også bidra til å forbedre forskrivning beslutninger og kliniske utfall.
Soppdrepende mottakelighet vurderes vanligvis ved å måle minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) som er definert som den laveste narkotika konsentrasjonen som resulterer i en betydelig reduksjon i veksten av en microorganism forhold til en medikamentfri vekst kontroll. De kliniske og Laboratory Standards Institute (CLSI) og europeiske komité på antimikrobielle mottakelighet Testing (EUCAST) har standardisert mottakelighet teste metoder for å gjøre MIC besluttsomhet mer nøyaktig og konsekvent7, 8. Nytten av soppdrepende MIC imidlertid begrenset spesielt for echinocandins, spesielt med hensyn til inter-laboratory sammenligninger der ulike metoder og betingelser er brukt9. Det er også usikker korrelasjon mikrofoner med respons på echinocandin behandling og manglende evne til å skille WT (eller utsatt) isolerer fra de skjuler FKS mutasjoner (echinocandin-resistente stammer)10,11. Til tross for tilgjengelighet for bekreftende single-genet PCRene og Sanger sekvensering av soppdrepende motstand markører, realisering av resultatene er ofte forsinket på grunn av samtidige påvisning av flere motstand markører5,12. Derfor tilbyr samtidige påvisning av motstand-overdragelse mutasjoner på forskjellige steder i genomet, aktiveres av hele genomet sekvensering-basert analyse, betydelige fordeler fremfor gjeldende tilnærminger.
Hele genomet sekvensering (WGS) har blitt implementert for å spore smitteoverføring under utbrudd samt tilnærming for genomet hele risiko vurdering og narkotika testing i bakterier og virus13. Nylige fremskritt innen nukleinsyre sekvensering teknologi har gjort den hele genom sekvensering (WGS) av patogener i en klinisk praktisk turn-rundt-tid både teknisk og økonomisk gjennomførbar. DNA sekvensering har viktige fordeler over andre metoder for patogen identifikasjon og karakterisering ansatt i mikrobiologi laboratorier14,15,16. Først, gir det en universell løsning med høy gjennomstrømning, hastighet og kvalitet. Kan brukes på noen av mikroorganismer og lar stordriftsfordeler på lokalt eller regionalt laboratorier. Andre produserer i et “fremtidssikret” format mottakelig for sammenligning på nasjonale og internasjonale nivåer. Til slutt, potensielle nytten av WGS i medisin har blitt utvidet med den raske veksten av offentlige databaser som inneholder referanse genomer, som kan knyttes til tilsvarende databaser som inneholder flere kliniske og epidemiologisk metadata17 ,18.
Nyere studier har vist nytten av WGS for identifikasjon av soppdrepende motstand markører fra kliniske isolater av Candida spp. 10 , 19 , 20. Dette er hovedsakelig på grunn av tilgjengeligheten av høy gjennomstrømming Borstemmaskin sequencere, etablerte bioinformatikk rørledninger og redusere kostnadene for sekvensering21,22. Fordelen med sopp WGS over Sanger sekvensering er at WGS tillater sekvensering av flere genomer på enkelt kjøre. I tillegg kan WGS av Candida genomer identifisere romanen mutasjoner i narkotika mål, spore genetisk evolusjon og fremveksten av klinisk relevante sekvens-typer20,22,23. Viktigst, i tilfeller av iboende multidrug motstand kan WGS hjelpe tidlig deteksjon av motstand-overdragelse mutasjoner før behandling utvalg22,24.
Her undersøkt vi muligheten for WGS-aktiverte screening for mutasjoner forbundet med resistens til ulike klasser av soppdrepende midler. Vi presenterer en metode for implementering av WGS fra sluttbruker og diagnostiske mykologi laboratorium perspektiver. Vi inkludert i denne analysen tre isolere par kultivert fra tre separate kliniske tilfeller i som i vitro echinocandins og 5-flucytosine utviklet over tid etter soppdrepende behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien fastsatt gjennomførbarhet, omtrentlig tidslinjer og presisjon av WGS-guidede deteksjon av resistens i C. glabrata. Tiden (TAT) bibliotek og sekvensering var fire dager og rapportering av analysert resultatene en til to dager. Dette sammenligner med minst like mye TAT for mottakelighet analyser fra kultur plater og Sanger sekvensering med betydelig høyere antallet eksempler. Rundt 30-90 C. glabrata genomer kan være sekvensert basert på sekvensering flyt-celle kapasitet, med 80-100% sekv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Centre for infeksjonssykdommer og mikrobiologi, offentlig helse. Forfatterne har ikke mottatt andre midler til denne studien. Forfatterne takker Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann og Ranjeeta Menon for deres råd og hjelp med hele genomet sekvensering eksperiment.
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
