Intero Genome Sequencing di glabrata del Candida per rilevazione di marcatori di antifungini farmaco resistenza
Summary
Questo studio ha implementato il sequenziamento del genoma intero per l’analisi di mutazioni in geni che conferiscono resistenza ai farmaci antifungini in glabrata del Candida. Glabrata del c. isolati resistenti agli echinocandine, azoli e 5-flucitosina, sono stati sequenziati per illustrare la metodologia. Profili di predisposizione degli isolati correlata con la presenza o l’assenza di modelli specifici di mutazione nei geni.
Abstract
Glabrata del candida è in grado di acquisire rapidamente le mutazioni che provocano resistenza ai farmaci, soprattutto di azoli ed echinocandine. Identificazione delle mutazioni genetiche è essenziale, come rilevata resistenza in vitro può spesso essere correlata con guasto clinico. Abbiamo esaminato la fattibilità dell’utilizzo di sequenziamento dell’intero genoma (WGS) per l’analisi del genoma della resistenza ai farmaci antifungini in glabrata del c. L’obiettivo era fattori abilitanti riconoscibili e barriere nell’implementazione WGS e misurarne l’efficacia. Questo documento delinea il punti di controllo chiave di controllo di qualità e componenti essenziali della metodologia WGS per indagare i marcatori genetici associati con ridotta sensibilità agli agenti antifungosi. Si stima anche l’accuratezza dell’analisi dei dati e Disabilita-intorno-periodo di prova.
Fenotipica suscettibilità di 12 clinica e un ceppo ATCC di glabrata del c. è stata determinata attraverso prova antifungosa di predisposizione. Questi tre inclusi isolano coppie, da tre pazienti, che hanno sviluppato aumento nelle concentrazioni inibitorie minime di droga. In due coppie, la seconda isolare ogni coppia ha sviluppato resistenza alla echinocandine. Il secondo isolato della terza coppia sviluppato resistenza alla 5-flucitosina. Il rimanente composto da sensibili e resistenti dell’azolo isolati. Polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) in geni collegati alla resistenza echinocandine, azolici e 5-flucitosina sono stati confermati in isolati resistenti attraverso WGS utilizzando il sequenziamento di nuova generazione. Non-sinonimo SNPs nella resistenza antifungina sono stati identificati geni quali FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 e FCY2 . Nel complesso, una media del 98% del legge WGS degli isolati di glabrata del c. mappati il genoma di riferimento con una copertura di circa 75-fold profondità di lettura. I tempi e i costi erano paragonabili a Sanger sequenziamento.
In conclusione, WGS di glabrata del c. era fattibile nel rivelare le mutazioni di gene clinicamente significativi coinvolti nella resistenza alle classi di farmaci antifungini differenti senza la necessità di più reazioni di PCR/DNA sequencing. Questo rappresenta un passo positivo verso la creazione di capacità WGS nel laboratorio clinico per la rilevazione simultanea di sostituzioni che conferisce resistenza antifungina.
Introduction
Glabrata del candida è un agente patogeno sempre più incontrato con importanza come una specie che esibisce la resistenza per l’azoli e anche più recentemente, a echinocandine1,2,3. A differenza della diploide albicans del c., il genoma aploide di glabrata del c. potrebbe consentirle di acquisire mutazioni e sviluppare resistenza multifarmaco più facilmente. Co-resistenza a entrambe le classi di droga è stato anche segnalato4. Quindi, la valutazione precoce di predisposizione antifungosa e rilevamento di farmaco-resistenza di glabrata del c. è fondamentale per la terapia corretta, mirata anche come nel contesto di stewardship antifungino per limitare i driver della resistenza agli antimicrobici1 , 5 , 6. stabilire un flusso di lavoro efficiente per rilevare rapidamente la presenza di mutazioni conferma collegate ai biomarcatori di resistenza in isolati resistenti sarà anche contribuire a migliorare la prescrizione le decisioni e gli esiti clinici.
Antifungosa di predisposizione è solitamente valutata misurando la concentrazione inibitoria minima (MIC) che è definita come la più bassa concentrazione di farmaco che si traduce in una significativa riduzione nella crescita di un microrganismo paragonato a quello di una crescita di droga-libero controllo. Il Comitato europeo sul test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST) e Laboratory Standards Institute (CLSI) e clinici hanno standardizzato antibiogramma metodi al fine di rendere MIC determinazione più accurata e coerente7, 8. Tuttavia, l’utilità di antimicotico MIC rimane limitata soprattutto per le echinocandine, in particolare per quanto riguarda i confronti interlaboratorio dove diverse metodologie e condizioni sono usate9. C’è anche incerta correlazione dei microfoni con risposta al trattamento echinocandine e incapacità di distinguere WT (o sensibili) isolati da quelli che harboring FKS mutazioni (echinocandine-resistenti)10,11. Nonostante la disponibilità di conferma singolo gene PCRs e Sanger sequenziamento dei marcatori di resistenza antifungina, realizzazione di risultati è spesso in ritardo dovuto alla mancanza di rilevazione simultanea di più resistenza marcatori5,12. Quindi, simultanee rilevazione delle mutazioni che conferiscono resistenza in posizioni diverse nel genoma, attivata dall’analisi di sequenziamento-basata di intero genoma, offre vantaggi significativi rispetto alle attuali approcci.
Tutto il sequenziamento del genoma (WGS) è stato implementato con successo per tenere traccia di trasmissione della malattia durante le epidemie, come pure un approccio per valutazione e test in batteri e virus13di resistenza genoma rischio. Gli avanzamenti recenti nella tecnologia di sequenziamento degli acidi nucleici hanno fatto il sequenziamento dell’intero genoma (WGS) degli agenti patogeni in clinicamente actionable Disabilita-intorno-tempo sia tecnicamente ed economicamente fattibile. Sequenziamento del DNA offre importanti vantaggi rispetto ad altri metodi di identificazione dell’agente patogeno e caratterizzazione impiegate in laboratori di microbiologia14,15,16. Innanzitutto, fornisce una soluzione universale con qualità, velocità e produttività elevata. L’ordinamento può essere applicata a qualsiasi dei microrganismi e permette economie di scala a laboratori locali o regionali. In secondo luogo, essa produce dati in un formato di ‘futuro’ suscettibile di confronto a livello nazionale e internazionale. Infine, la potenziale utilità di WGS in medicina è stata aumentata dalla rapida crescita delle basi di dati pubblici contenenti genomi di riferimento, che possono essere collegati alle basi di dati equivalenti che contengono metadati aggiuntivi clinici ed epidemiologici17 ,18.
Recenti studi hanno dimostrato l’utilità di WGS per identificazione di marcatori di resistenza antifungina da isolati clinici di Candida spp. 10 , 19 , 20. questo è principalmente dovuto alla disponibilità di alto-rendimento benchtop sequencer, bioinformatica stabilito condotte e diminuendo il costo di sequenziamento21,22. Il vantaggio di WGS fungine su Sanger sequenziamento è che WGS permette di sequenziamento dei genomi multipli su una singola esecuzione. Inoltre, WGS di genomi di Candida può identificare mutazioni novelle nel target farmacologico, traccia l’evoluzione genetica e tipi di sequenza clinicamente rilevanti20,22,23. La cosa più importante, in caso di resistenza del multidrug intrinseca, WGS può aiutare nella diagnosi precoce delle mutazioni che conferiscono resistenza prima del trattamento selezione22,24.
Qui, abbiamo esaminato la fattibilità dello screening WGS-abilitato per mutazioni associate alla resistenza ai farmaci di diverse classi di agenti antifungini. Vi presentiamo una metodologia per l’implementazione di WGS da micologia diagnostica laboratorio prospettive e degli utenti finali. Abbiamo incluso in questa analisi tre isolare coppie coltivate da tre casi clinici separati in cui in vitro resistenza alla echinocandine e 5-flucitosina sviluppato nel tempo dopo il trattamento antimicotico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio ha determinato la fattibilità, sequenze temporali approssimativo e precisione di rilevazione WGS-Guida di farmaco-resistenza di glabrata del c. Il tempo di consegna (TAT) per la preparazione di biblioteca e il sequenziamento è stato quattro giorni e la segnalazione di uno-due giorni risultati analizzati. Ciò confronta con almeno una quantità simile TAT per i test di suscettibilità da piastre di coltura e Sanger sequenziamento con significativamente più alto numero di campioni. Circa 30-90 <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal centro per le malattie infettive e microbiologia, salute pubblica. Gli autori non hanno ricevuto altri finanziamenti per questo studio. Gli autori ringraziano Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann e Ranjeeta Menon per la loro consulenza e assistenza con l’esperimento di sequenziamento del genoma intero.
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
