Toute Genome Sequencing of Candida glabrata pour la détection de marqueurs de drogue antifongique résistance
Summary
Cette étude a mis en place le séquençage du génome entier pour l’analyse des mutations dans les gènes conférant une résistance aux médicaments antifongiques dans Candida glabrata. C. glabrata isolats résistants aux échinocandines, dérivés azolés et 5-flucytosine, ont été séquencés pour illustrer la méthodologie. Profils des isolats en corrélation avec la présence ou l’absence de motifs spécifiques de mutation dans les gènes de susceptibilité.
Abstract
Candida glabrata peut acquérir rapidement des mutations qui entraînent la résistance aux médicaments, surtout pour les dérivés azolés et les échinocandines. Identification des mutations génétiques est essentielle, comme la résistance observée in vitro peut souvent être corrélée avec l’échec clinique. Nous avons examiné la possibilité d’utiliser le séquençage du génome entier (WGS) pour l’analyse du génome de la résistance aux médicaments antifongiques dans c. glabrata. Le but était concrètement catalyseurs et obstacles dans la mise en place de groupes de travail et mesure son efficacité. Cet article décrit les points de contrôle clés contrôle de la qualité et les éléments essentiels de la méthodologie groupes de travail pour étudier les marqueurs génétiques associés à une sensibilité réduite aux agents antifongiques. Il estime également l’exactitude de l’analyse des données et tour-temps de test.
Une sensibilité phénotypique de 12 cliniques et une souche ATCC de c. glabrata a été déterminée par des tests de sensibilité aux antifongique. Ces trois inclus isolent paires, de trois patients, qui a mis au point la hausse des concentrations minimales inhibitrices de drogue. Dans deux paires, la seconde souche de chaque paire développé de résistance aux échinocandines. Le deuxième isolat de la troisième paire développé une résistance aux 5-flucytosine. Le reste comprend sensibles et résistantes aux azolés isolats. Simples de nucléotide simple (SNP) dans les gènes liés à la résistance échinocandine, azole et 5-flucytosine ont été confirmés dans des isolats résistants à travers WGS utilisant le séquençage de la génération suivant. Non-synonymes SNP antifongique résistance gènes tels que FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 et FCY2 ont été identifiés. Dans l’ensemble, une moyenne de 98 % des lectures WGS des isolats de c. glabrata mappées sur le génome de référence avec une couverture d’environ 75-fold profondeur. Le délai d’exécution et le coût ont été comparables à Sanger séquençage.
En conclusion, WGS de c. glabrata était réalisable en révélant des mutations du gène cliniquement significatifs impliqués dans la résistance aux médicaments antifongiques différents classes sans nécessiter de multiples réactions de séquençage PCR/ADN. Il s’agit d’un pas positif vers la mise en place WGS capacité dans les laboratoires cliniques pour la détection simultanée des substitutions attributive de résistance aux antifongiques.
Introduction
Candida glabrata est un pathogène de plus en plus rencontré avec importance comme une espèce qui montre résistance les azoles ainsi que plus récemment, les échinocandines1,2,3. À la différence des diploïdes c. albicans, le génome haploïde de c. glabrata peut lui permettre d’acquérir des mutations et de développer la multirésistance plus facilement. Co la résistance aux deux classes de médicaments a également été rapportée4. Par conséquent, l’évaluation précoce de sensibilité aux antifongique et détection de la résistance aux antituberculeux au c. glabrata sont cruciales pour le bon traitement ciblé ainsi que dans le contexte de l’intendance antifongique pour limiter les facteurs de résistance aux antimicrobiens1 , 5 , 6. création d’un workflow efficace pour détecter rapidement la présence de mutations confirmation liés aux biomarqueurs de résistance dans des isolats résistants va également contribuer à une meilleure prescription les décisions et les résultats cliniques.
Sensibilité aux antifongique est généralement évaluée en mesurant la concentration minimale inhibitrice (CMI) qui est définie comme la plus faible concentration de drogue qui se traduit par une réduction significative de la croissance d’un microorganisme comparée à celle d’une croissance sans drogue contrôle. La clinique et le Laboratory Standards Institute (CLSI) et le Comité européen sur Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ont normalisé la sensibilité des méthodes d’essai afin de rendre la détermination MIC plus précise et cohérente7, 8. Cependant, l’utilité de MIC antifongique reste limitée surtout pour les échinocandines, en particulier en ce qui concerne les comparaisons interlaboratoires où différentes méthodes et les conditions sont utilisés9. Il existe également une corrélation incertaine des PRI avec la réponse au traitement d’échinocandine et incapacité à distinguer WT (ou sensibles) isolats de celles hébergeant FKS mutations (souches résistantes échinocandine)10,11. Malgré la disponibilité de confirmation monogéniques RFT et Sanger séquençage des marqueurs de résistance aux antifongiques, réalisation des résultats est souvent retardée à l’absence de détection simultanée de multiples résistance marqueurs5,12. Par conséquent, détection simultanée des mutations conférant la résistance à différents endroits dans le génome, activée par l’analyse basée sur le séquençage du génome entier, offre des avantages significatifs sur les approches actuelles.
(WGS) le séquençage du génome a été implanté avec succès afin de suivre la transmission de la maladie au cours des flambées, mais aussi une approche de test dans les bactéries et les virus13de résistance évaluation et drogues risque de génome. Avances récentes en technologie de séquençage des acides nucléiques ont fait le séquençage du génome entier (WGS) d’agents pathogènes dans un tour-autour-temps cliniquement exploitable techniquement et économiquement faisable. Séquençage de l’ADN offre d’importants avantages par rapport aux autres méthodes d’identification de l’agent pathogène et caractérisation employées dans les laboratoires de microbiologie14,15,16. Premièrement, il fournit une solution universelle avec la qualité, la vitesse et à haut débit. Séquençage peut être appliqué à l’un des micro-organismes et permet des économies d’échelle dans les laboratoires les ou régionaux. Deuxièmement, il génère des données dans un format « évolutif » se prêtent à la comparaison aux niveaux nationales et international. Enfin, l’utilité potentielle des groupes de travail en médecine a été augmentée par la croissance rapide des bases de données publiques contenant les génomes de référence, qui peuvent être reliés à des bases de données équivalentes qui contiennent des métadonnées supplémentaires de cliniques et épidémiologiques17 ,18.
Des études récentes ont démontré l’utilité des groupes de travail pour l’identification des marqueurs de résistance aux antifongiques des isolats cliniques de Candida spp. 10 , 19 , 20. c’est principalement en raison de la disponibilité des séquenceurs haut débit benchtop, pipelines de bioinformatique établis et diminuant le coût du séquençage21,22. L’avantage de WGS fongique sur Sanger séquençage est que WGS permet le séquençage des génomes de plusieurs sur un même essai. En outre, WGS des génomes de Candida peut identifier des mutations nouvelles cibles de médicaments, la piste évolution génétique et l’émergence des séquences-types cliniquement pertinents20,22,23. Plus important encore, en cas de multirésistance intrinsèque, WGS peut aider à la détection précoce des mutations mutantes résistantes avant traitement sélection22,24.
Ici, nous avons examiné la faisabilité du dépistage WGS-activé des mutations associées à la résistance à différentes classes d’agents antifongiques. Nous présentons une méthodologie pour la mise en œuvre des groupes de travail de l’utilisateur final et les perspectives de laboratoire de diagnostic mycologique. Nous avons inclus dans cette analyse trois isoler des paires d’échantillons de trois cas cliniques distinctes dans lequel in vitro la résistance aux échinocandines et 5-flucytosine au fil du temps suite à un traitement antifongique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude a déterminé faisabilité, délais approximative et la précision de détection WGS-guidée de la pharmacorésistance dans c. glabrata. Le délai (TAT) pour la préparation de la bibliothèque et le séquençage a été de quatre jours et la déclaration des jours d’une à deux résultats analysés. Cela se compare au moins un montant similaire TAT pour des analyses de sensibilité des plaques de culture et Sanger sequencing avec un nombre significativement plus élevé d’échantillons. Environ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Centre d’infectiologie et de microbiologie, de la santé publique. Les auteurs n’ont pas reçu tout autre financement pour cette étude. Les auteurs remercient les Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann et Ranjeeta Menon de leurs conseils d’experts et d’assistance avec l’expérience de séquençage du génome entier.
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
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