Это исследование реализован всего генома для анализа мутаций в генах, присвоении противогрибковым препаратам в Candida glabrata. C. glabrata изолятов устойчивых к echinocandins, азолов и 5-флуцитозин, были упорядочены для иллюстрации методологии. Восприимчивость профили изолятов, связаны с наличием или отсутствием структур конкретных мутаций в генах.
Кандида glabrata можно быстро приобрести мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости, особенно для азолов и echinocandins. Определение генетических мутаций имеет важное значение, как сопротивление обнаруженные в vitro часто может быть соотнесена с клинической недостаточностью. Мы изучили возможность использования всего генома (РГ) для анализа генома общесистемной противогрибковым препаратам в C. glabrata. Цель была и создают условия и препятствия в осуществлении WGS и оценивать ее эффективность. В этом документе изложены основные качества контроля контрольно-пропускных пунктов и основных компонентов WGS методологии для изучения генетических маркеров, связанные с уменьшенной восприимчивости к противогрибковых препаратов. Она также оценивает точность анализа данных и поворот вокруг времени тестирования.
Фенотипические восприимчивость 12 клинических и один ATCC штамм C. glabrata был определен путем противогрибковые восприимчивость тестирования. Эти включены три изолировать пар, из трех пациентов, разработанные рост минимальный тормозной концентрации наркотиков. В две пары второй изолировать каждой пары разработан сопротивления echinocandins. Второй изолировать третьей пары развилась устойчивость к 5-флуцитозин. Оставшиеся состоит из восприимчивых и устойчивостью азол изолятов. Единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генов, связанных с echinocandin, азол и 5-флуцитозин сопротивления были подтверждены в устойчивые изолятов через WGS, с помощью следующего поколения последовательности. Non синоним ОНП в противогрибковые сопротивления, были определены гены как FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 и FCY2 . В целом, в среднем 98% говорится WGS изолятов C. glabrata , сопоставляются с геном ссылку с охватом около 75-fold чтения глубины. Сроки и стоимость, были сопоставимы с Сэнгер последовательности.
В заключение WGS C. glabrata было возможно в выявление мутаций гена клинически, участвующих в сопротивлении классов различных противогрибковый препарат без необходимости использования нескольких последовательности реакций ПЦР/ДНК. Это представляет собой позитивный шаг на пути к созданию WGS возможности в клинической лаборатории для одновременного обнаружения противогрибковые сопротивления присвоении замен.
Кандида glabrata это все чаще встречающихся возбудителя с значение как вид, который проявляет устойчивость к азолов, а также совсем недавно,1,echinocandins,2,,3. В отличие от диплоидных C. albicansгаплоидным геномом C. glabrata может позволить ему приобрести мутации и более легко развить множественной лекарственной устойчивости. Совместное сопротивление для обоих классов наркотиков был также сообщили4. Таким образом ранние оценки противогрибковые восприимчивости и выявления лекарственной устойчивости в C. glabrata имеет решающее значение для правильного, целевые терапии в контексте противогрибковые руководством ограничить водителей антибиотикорезистентности1 , 5 , 6. Создание эффективного рабочего процесса быстро обнаружить наличие подтверждающих мутаций, связанных с Сопротивления биомаркеров в устойчивые изолятов будет также поможет улучшить предписывающих решениях и клинические исходы.
Противогрибковые восприимчивости обычно оценивается путем измерения минимальный тормозной концентрации (MIC), которая определяется как низкая концентрация препарата, что приводит к значительному сокращению темпов роста по сравнению с немедикаментозными роста микроорганизма управления. Клинические и лабораторные стандарты Института (CLSI) и Европейского комитета по тестирования по антимикробной чувствительности (EUCAST) имеют стандартизированные методы испытаний для определения MIC восприимчивости более точной и последовательной в7, 8. Однако утилита противогрибковые MIC остается ограниченным особенно для echinocandins, в частности отношении межлабораторных сравнений различных методологий и условия которых используются9. Существует также неопределенной корреляции с ответом на лечение echinocandin и неспособность отличить WT Мико (или подверженных) изоляты от тех, кто укрывает FKS мутации (echinocandin устойчивые штаммы)10,11. Несмотря на наличие подтверждающих сингл ген ГКДЗ и Сэнгер последовательности противогрибковые сопротивление, реализация результатов часто задерживается из-за отсутствия одновременного обнаружения нескольких сопротивления маркеры5,–12. Следовательно параллельных обнаружения сопротивления вручение мутаций в разных местах в геноме, включаемые на основе последовательности анализа всего генома, предлагает значительные преимущества в сравнении с текущими подходами.
Весь геном последовательности (РГ) успешно реализованы для отслеживания передачи болезни во время вспышек, а также подход для генома общесистемного риска оценки и наркотиков сопротивления, тестирование в13бактерий и вирусов. Последние достижения в технологии секвенирование нуклеиновой кислоты сделали всего генома (РГ) патогенов в клинически осуществимое поворот вокруг времени технически и экономически осуществимы. Секвенирования ДНК обеспечивает важные преимущества по сравнению с другими методами идентификации возбудителя и характеристика, занятых в микробиологии лаборатории14,,1516. Во-первых он обеспечивает универсальное решение с высокой пропускной способностью, скорость и качество. Последовательность может быть применен к любой из микроорганизмов и позволяет масштаба на местных или региональных лабораторий. Во-вторых он производит данные в формате «будущее» поддаются сравнения на национальном и международном уровнях. Наконец был увеличен потенциальной полезности WGS в медицине быстрый рост общественного данных баз, содержащих ссылку геномов, которые могут быть связаны с базы эквивалентных данных, которые содержат дополнительные метаданные клинических и эпидемиологических17 ,18.
Недавние исследования продемонстрировали полезность WGS для идентификации противогрибковые сопротивления маркеров из клинических изолятов Candida spp. 10 , 19 , 20. это главным образом объясняется наличие высокой пропускной способностью benchtop секвенсеры, установленным биоинформатики трубопроводов и снижается стоимость секвенирования21,22. Преимущество грибковых WGS Сэнгер, последовательности, что РГ позволяет секвенирования геномов несколько на один запуск. Кроме того РГ Candida геномов может идентифицировать новые мутации в наркотиков цели, отслеживать генетической эволюции и появление клинически значимых типов последовательности20,,2223. Самое главное в случае внутренней множественной лекарственной устойчивости, WGS может помочь раннего выявления мутаций присвоении сопротивления до лечения выбор22,24.
Здесь мы изучили возможности WGS-поддержкой скрининга для мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью к различным классам противогрибковых препаратов. Мы представляем методологии для осуществления WGS с точки зрения лабораторных диагностических микология и конечных пользователей. Мы включили в этот анализ, что три изолировать пар, культивированный из трех отдельных клинических случаев, в которых в vitro устойчивость к echinocandins и 5-флуцитозин разработаны со временем, после противогрибковое лечение.
Это исследование определяет целесообразность, приблизительные сроки и точность обнаружения WGS-руководствуясь лекарственной устойчивости в C. glabrata. Время обработки (ТАТ) для подготовки библиотека и последовательности было четыре дня и отчетности проанализированы результаты одно?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана центра инфекционных заболеваний и микробиологии, общественного здравоохранения. Авторы не получили каких-либо других источников финансирования для этого исследования. Авторы благодарят Drs Alicia Арнотт, Натан Бахман и Ranjeeta Менон за их квалифицированную консультацию и помощь с весь геном последовательности эксперимент.
DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |