طريقة محسنة لجمع السائل الدماغي النخاعي من الفئران تخديره
Summary
ويصف هذا البروتوكول تقنية محسنة لمجموعة وفيرة من السائل الدماغي النخاعي (CSF) مع أي تلوث من الدم. مع أكبر جمع العينات والنقاء، يمكن إجراء مزيد من التحليلات باستخدام قوات الأمن المركزي لزيادة فهمنا للأمراض التي تصيب المخ والحبل الشوكي.
Abstract
السائل الدماغي النخاعي (CSF) سائل الجسم قيماً للتحليل في أبحاث علم الأعصاب. هو واحد من السوائل على اتصال أوثق بالجهاز العصبي المركزي، وهكذا، يمكن استخدامها لتحليل حالة المريضة من الدماغ أو الحبل الشوكي دون الوصول مباشرة إلى هذه الأنسجة. ومع ذلك، في الفئران من الصعب الحصول على ماغنا تشيستيرنا نظراً للتقارب في الأوعية الدموية، التي غالباً ما تلوث العينات. المنطقة لجمع السائل الدماغي النخاعي في الفئران من الصعب أيضا تشريح ويتم الحصول على عينات صغيرة غالباً فقط (الحد الأقصى من 5-7 ميليلتر أو أقل). يصف هذا البروتوكول بالتفصيل أسلوب الذي يحسن في الأساليب الحالية لجمع لتقليل التلوث من الدم والسماح لمجموعة وفيرة من السائل الدماغي النخاعي (في المتوسط يمكن أن تجمع 10-15 ميليلتر). يمكن استخدام هذا الأسلوب مع غيرها من أساليب التشريح لجمع الأنسجة من الفئران، كما أنها لا تؤثر على أي أنسجة أثناء استخراج السائل الدماغي النخاعي. وهكذا، المخ والحبل الشوكي لا تتأثر بهذا الأسلوب، وتظل على حالها. مع أكبر جمع عينة السائل النخاعي والنقاء، مزيد من التحليلات يمكن استخدامها مع هذا البحث الأعصاب السوائل لزيادة المعونة، وفهم أفضل للأمراض التي تصيب المخ والحبل الشوكي.
Introduction
الخدمات القطرية سائل الجسم قيماً للتحليل في أبحاث علم الأعصاب. الخدمات القطرية يتكون أساسا من بلازما الدم، التي تحتوي على بعض الخلايا (لا خلايا الدم الحمراء وخلايا الدم البيضاء قليلة فقط)، وهي خالية تقريبا من البروتين. أنها واحدة من السوائل على اتصال وثيق مع الجهاز العصبي المركزي (CNS) وأنه يمكن تمرير الشوارد العديد من من المخ والحبل الشوكي إلى النظام الطرفية. في البشر، وعينات السائل الدماغي النخاعي يمكن جمعها للمساعدة في تشخيص المرض، أو لأغراض البحث في التجارب السريرية، كالعمود الفقري الحنفية (أو البزل القطني) هو إجراء طفيفة والغازية: السائل السائل الدماغي النخاعي يمكن أن تعكس التغيرات في الجهاز العصبي المركزي دون الحاجة إلى الوصول مباشرة إلى هذه الأنسجة. وهكذا، وفي السنوات الأخيرة، لأغراض البحث في العيادة، حصلت عينات السائل الدماغي النخاعي من مرضى أمراض الأعصاب مثل مرض الزهايمر وغيرها2،ديمينتياس،من13. وهناك العديد من فحوصات العلامات البيولوجية التي تم تطويرها باستخدام عينات السائل الدماغي النخاعي يحتمل أن تكون المساعدة في تشخيص الأمراض في عيادة2،3. ومع ذلك، هناك الكثير من النقاش حول موثوقية هذه الاختبارات لتحقيق نتائج متسقة والحساسة لتشخيص المرض4،5على وجه التحديد. لذا، هناك حاجة كبيرة لوضع أفضل من فحوصات والأهداف، التي يمكن العثور عليها في إطار الخدمات القطرية، للمساعدة في إنتاج تقنية قياسية لتشخيص أمراض الأعصاب بحساسية وخصوصية أكبر. نظراً للأهمية المحتملة للبشرية عينات CSF في الأمراض، جمع السائل النخاعي من القوارض في أبحاث علم الأعصاب أيضا للفائدة.
الفئران الحيوانات هامة في البحوث الطبية والبيولوجية والسماح للاختبار لإثبات مفهوم الدراسات قبل التجارب السريرية البشرية والمركبات العلاجية المحتملة. ومع ذلك، في الفئران من الصعب الحصول على عينات السائل الدماغي النخاعي نظراً لأن قربه من الدماغ في حيوانات صغيرة، كما الأسلوب المعتاد لمجموعة الخدمات القطرية في الفئران الحصول عليه عن طريق السيستيرنا ماجنا، فتح بين المخيخ والظهريه سطح سيسائيه لب. وهذا يسبب صعوبة في جمع عينات السائل الدماغي النخاعي كما من الصعب تشريح لهذا المجال أو بالقرب من الأوعية الدموية، ويزيد من خطر التلوث من خلايا الدم. نظراً لهذه الصعوبات، يمكن لمعظم الباحثين فقط الحصول على كمية صغيرة من السائل الدماغي النخاعي للتحليل (وعادة ما ذكر ميليلتر 5-7) وتلوث عينات السائل الدماغي النخاعي بخلايا الدم هو الشاغل الرئيسي للتحليلات6،،من78 , 9-تلوث الدم يمكن أن يحجب النتائج وليس حقاً تعكس الحالة من الجهاز العصبي المركزي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر عينة محدودة جمعت البحوث حسب المبلغ المعتاد التي جمعت من الفئران بما فيه الكفاية لقياس واحد فقط (في تكرار أو ثلاث نسخ) باستخدام مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA). وهكذا، مجمعة عينات السائل الدماغي النخاعي عادة من الفئران متعددة كي يكون عينة كافية لتشغيل فحوصات متعددة. وضع بروتوكول لوفرة، جمع غير ملوثة من السائل النخاعي من الفئران هو المطلوب إلى حد كبير وسوف تكون مفيدة في تحسين بحوث علم الأعصاب باستخدام القوارض.
في هذا البروتوكول، تقنية لوفرة (في متوسط 10-15 ميليلتر) مجموعة من الخدمات القطرية من الفئران تخديره هو وصف بالتفصيل ويقوم بتحسين طريقة جمع السائل الدماغي النخاعي لتقليل التلوث من الدم10معروفة حاليا. بروتوكول قوية لجمع السائل الدماغي النخاعي سيساعد في تطوير فحوصات العلامات البيولوجية على أساس الخدمات القطرية، التي يمكن استخدامها للمساعدة في تشخيص المرض، فضلا عن تحسين البحث في الآليات التي تكمن وراء الأمراض التي تؤثر الجهاز العصبي المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل أسلوب الذي يحسن في الأساليب الحالية10 جمع السائل الدماغي النخاعي لتقليل التلوث من الدم، والسماح لمجموعة وفيرة من الخدمات القطرية (في المتوسط ~ يمكن الحصول على 10-15 ميليلتر) من الفئران. عند كسر تلميح الشعرية، غيض من الشعرية لا ينبغي صغيرة جداً (كما ثم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا العمل “الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية” (81650110527، 81371400) و “الوطنية المفتاح الأساسي البحث برنامج الصين” (2013CB530900).
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer’s Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer’s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer’s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer’s Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer’s disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer’s Dement. , (2016).
- You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
