一种改进的麻醉小鼠脑脊液采集方法
Summary
本协议描述了一种改进的技术, 用于丰富的脑脊液 (CSF), 不污染血液。随着样品的收集和纯度的增加, 可以通过脑脊液进行更多的分析, 进一步了解影响大脑和脊髓的疾病。
Abstract
脑脊液 (CSF) 是一种有价值的体液, 用于分析神经科学研究。它是最接近中枢神经系统的液体之一, 因此可以用来分析大脑或脊髓的患病状态而不直接进入这些组织。然而, 小鼠由于与血管的亲近而难以从大池获得, 这通常会污染样本。小鼠的脑脊液采集面积也很难解剖, 而且通常只有小样本 (最多5-7 µL 或更少)。该协议详细描述了一种技术, 改进现有的收集方法, 以尽量减少血液污染, 并允许大量收集脑脊液 (平均10-15 µL 可以收集)。这种技术可以与其他解剖方法, 从小鼠组织收集, 因为它不会影响任何组织在脑脊液提取。因此, 大脑和脊髓不受这种技术的影响, 并保持不变。随着脑脊液样品的收集和纯度的增加, 更多的分析可以用来进一步帮助神经科学研究, 更好地了解影响大脑和脊髓的疾病。
Introduction
脑脊液是一种有价值的体液, 用于分析神经科学研究。脑脊液主要由血浆组成, 含有少量细胞 (没有红细胞, 只有少数白细胞), 几乎无蛋白质。它是与中枢神经系统 (CNS) 紧密接触的液体之一, 它可以将许多电解质从大脑和脊髓传给外围系统。在人类中, 可以收集脑脊液样本以帮助诊断疾病或临床试验中的研究目的, 因为脊椎穿刺 (或腰椎穿孔) 是一种轻微的侵入性手术: 脑脊液可以反映中枢神经系统的变化, 而无需直接访问这些组织.因此, 近年来, 为临床研究目的, 脑脊液样本已获得从神经退行性疾病的患者, 如阿尔茨海默病和其他痴呆1,2,3。有许多生物标志物的研究已经开发使用脑脊液样本, 以潜在的帮助诊断疾病的诊所2,3。然而, 对于这些化验的可靠性, 有很多争论, 以产生一致的, 敏感的结果, 专门诊断疾病4,5。因此, 有必要发展更好的检测和指标, 可以在脑脊液中找到, 以帮助生产一种标准技术, 以更大的灵敏度和特异性诊断神经变性疾病。由于人体脑脊液样本在疾病中的潜在重要性, 在神经科学研究中采集啮齿目动物的脑脊液也很有兴趣。
小鼠是生物学和医学研究中的重要动物, 在人类临床试验之前, 允许对潜在的治疗化合物和概念证明研究进行测试。然而, 在小鼠很难获得脑脊液标本由于它接近大脑在一个小动物, 因为通常的脑脊液收集方法是通过大池获得, 在小脑和延髓背表面之间的开放。这导致采集脑脊液标本困难, 因为这一地区很难解剖, 并与血管接近, 增加了血细胞污染的风险。由于这些困难, 大多数研究人员只能获得少量的脑脊液进行分析 (通常说是5-7 µL), 并且血液细胞对脑脊液样品的污染是分析6、7、8的主要关注因素。,9. 血液污染会使结果模糊不清, 并不能真正反映中枢神经系统的状态。此外, 有限样本收集可以影响研究, 因为通常的数量从小鼠是足够的只有一个测量 (重复或三个) 使用酶联免疫吸附试验 (ELISA)。因此, 脑脊液标本通常是从多个小鼠汇集, 以便有足够的样本来运行多种化验。为大量、无污染的小鼠脑脊液收集提供了一个协议, 这对改善利用啮齿动物进行神经科学研究是有益的。
在本议定书中, 详细描述了从麻醉小鼠中大量 (平均10-15 µL) 收集脑脊液的技术, 并改进了目前已知的脑脊液收集方法, 以最大限度地减少血液中的污染10。一个强健的脑脊液收集协议将有助于开发基于脑脊液的生物标志物化验, 这可以用来帮助诊断疾病, 并改进对影响中枢神经系统疾病的机制的研究。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议详细描述了一种技术, 它改进了现有方法10脑脊液收集, 以最大限度地减少血液污染, 并允许大量收集脑脊液 (平均约10-15 µL 可获得) 从小鼠。当打破毛细管尖端, 毛细管的尖端不应该太小 (因为然后脑脊液将被提取非常缓慢) 或太大 (将不够罚款, 以收集脑脊液和组织可以成为在毛细管)。在解剖脑脊液收集区域时应注意: 应停止任何出血, 并将玻璃毛细管的插入区域与 dH2</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国国家自然科学基金 (81650110527、81371400) 和中国国家重点基础研究项目 (2013CB530900) 的支持。
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
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