Усовершенствованный метод для коллекции спинномозговой жидкости от наркотизированных мышей
Summary
Этот протокол описывает улучшения техники для коллекции обильные цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) с не загрязнение от крови. С большей выборки и чистоты больше анализов может выполняться с использованием ФГО для дальнейшего понимания болезней, которые влияют на мозг и спинной мозг.
Abstract
Спинномозговой жидкости (СМЖ) является ценным жидкости тела для анализа в неврологии исследований. Он является одним из жидкости в ближайший контакт с центральной нервной системой и таким образом, может использоваться для анализа состояние больной головного или спинного мозга без прямого доступа к эти ткани. Однако мышей, которые трудно получить от Чистерна magna из-за его близости к кровеносных сосудов, которые часто загрязняют образцы. Области сбора ФГО в мышей также сложно рассекать на и часто лишь небольшие образцы получены (максимум 5-7 мкл или меньше). Этот протокол описывает подробно технику, которая улучшает на текущие методы сбора для сведения к минимуму загрязнения от крови и обильные коллекции спинномозговой жидкости (в среднем, собранные 10-15 мкл). Этот метод может использоваться с другими методами рассечение ткани коллекции от мышей, как она не оказывает влияния любых тканей во время извлечения CSF. Таким образом головного и спинного мозга с этой техникой не затрагиваются и остаются нетронутыми. С большей сбор образцов спинномозговой жидкости и чистоты больше анализов могут быть использованы с этой жидкости для дальнейшей помощи неврологии исследований и лучше понять заболеваний головного и спинного мозга.
Introduction
Спинномозговой жидкости является ценной жидкости тела для анализа в неврологии исследований. ФГО главным образом сделаны из плазмы крови, содержащий несколько клеток (нет красных кровяных клеток и только несколько белых кровяных клеток) и почти белка-бесплатно. Это один из жидкости в тесном контакте с центральной нервной системы (ЦНС) и он может передать многие электролитов из головного и спинного периферической системы. В организме человека, образцов спинномозговой жидкости могут быть собраны для помощи в диагностике болезней или для исследовательских целей в клинических испытаниях, как спинномозговой пункции (или поясничный прокол) несовершеннолетнего, инвазивные процедуры: CSF жидкости может отражать изменения в ЦНС без необходимости для прямого доступа к ним тканей. Таким образом в последние годы, для исследовательских целей в клинике, CSF образцы были получены от больных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и другими видами деменции1,2,3. Существует много биомаркер анализов, которые были разработаны с использованием образцов спинномозговой жидкости для потенциально помочь в диагностике заболеваний в клинике2,3. Однако есть много дебатов на надежность этих анализов результатов последовательным, чувствительных специально диагностировать болезни4,5. Таким образом существует большая потребность развития лучше анализов и целевых показателей, которые могут быть найдены в спинномозговой жидкости, чтобы помочь в производстве стандартный метод диагностики нейродегенеративных заболеваний с большей чувствительностью и специфичностью. Ввиду потенциальной важности человеческого образцов спинномозговой жидкости в болезни коллекция спинномозговой жидкости от грызунов в неврологии исследования также представляет интерес.
Мышей являются важными животных в биологических и медицинских исследованиях и позволяют для проверки потенциальных терапевтических соединений и доказательства в концепция исследования перед клинические испытания на человеке. Однако у мышей трудно получить образцов спинномозговой жидкости из-за его близости к мозгу в маленькое животное, как обычный метод коллекции ФГО в мышах для получения через Чистерна magna, открытие между дорсальной поверхности продолговатого мозга и мозжечке. Это вызывает трудности в сборе образцов спинномозговой жидкости, как трудно анализировать в этой области и в непосредственной близости от кровеносных сосудов, увеличивает риск заражения от клеток крови. Из-за эти трудности большинство исследователей могут получить только небольшое количество ЦСЖ для анализа (как правило, указывается как 5-7 мкл) и загрязнение образцов спинномозговой жидкости клетками крови является предметом главной озабоченности для анализа6,,78 , 9. загрязнение крови может скрывать результаты и не действительно отражают состояние центральной нервной системы. Кроме того, небольшая выборка собранных может повлиять исследований как обычная сумма собранных от мышей является достаточно только одного измерения (в двух экземплярах или экземплярах) с помощью энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA). Таким образом образцов спинномозговой жидкости, обычно пул из нескольких мышей для того чтобы иметь достаточно образца для запуска нескольких анализов. Разработка протокола для обильные, незагрязненный коллекция спинномозговой жидкости от мышей значительно желаемого и будет полезным в улучшение нейронауки исследование с помощью грызунов.
В этом протоколе, техника для обильные (в среднем 10-15 мкл) коллекция ликвора из наркотизированных мышей подробно описан и улучшает на в настоящее время известный метод коллекции ФГО для сведения к минимуму загрязнения от крови10. Надежный протокол для ФГО коллекции будет помощь в разработке на основе спинномозговой жидкости биомаркеров анализов, которые могут быть использованы для помощи в диагностике заболеваний, а так же улучшить исследования в рамках механизмов, которые лежат в основе болезней центральной нервной системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает подробно технику, которая улучшает текущие методы10 ФГО коллекции для сведения к минимуму загрязнения от крови и обильные коллекции ликвора (в среднем ~ можно получить 10-15 мкл) от мышей. Когда нарушение капиллярного кончик, кончик капилляра не должно …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национальной естественных наук фонд Китая (81650110527, 81371400) и Национальный ключ базовых исследований программа Китая (2013CB530900).
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer’s Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer’s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer’s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer’s Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer’s disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer’s Dement. , (2016).
- You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
