Quantification absolue des micro-ARN plasmatique chez les singes Macaques, à l’aide de la Transcription inverse en temps réel Quantitative PCR
Summary
Ce rapport décrit un protocole de mesure des niveaux absolus de miRNA plasma, à l’aide de la transcription inverse en temps réel quantitative PCR avec ou sans pré amplification. Ce protocole permet de mieux comprendre la quantité de plasma miARN et permet une évaluation qualitative des données correspondantes de différentes études ou laboratoires.
Abstract
RT-qPCR est l’une des méthodes plus courantes pour évaluer des miARN cible individuelle. Les niveaux de miARN sont généralement mesurés par rapport à un échantillon de référence. Cette approche est appropriée pour l’examen des changements physiologiques dans le taux d’expression de gènes cibles. Cependant, quantification absolue en utilisant mieux l’analyse statistique est préférable pour une évaluation complète des niveaux d’expression de gène. Quantification absolue est toujours pas d’usage courant. Ce rapport décrit un protocole de mesure des niveaux absolus de plasma miRNA, utilisant la RT-qPCR avec ou sans pré amplification.
Un volume fixe (200 µL) de plasma EDTA a été préparé à partir le sang prélevé à la veine fémorale commune des singes cynomolgus consciente (n = 50). L’ARN total a été extrait en utilisant le système disponible dans le commerce. Plasma miARN ont été quantifiés par sonde RT-qPCR analyses qui contient la sonde et amorces PCR miRNA spécifique marche avant/marche arrière. Des courbes standard pour la quantification absolue ont été générés utilisant des oligonucléotides de RNA synthétiques disponibles dans le commerce. Un cel-miR-238 synthétique a été utilisé comme un contrôle externe pour la normalisation et l’évaluation. Les miARN qui présentaient de quantification des valeurs de cycle (Cq) au-dessus de 35 ont été pré amplifié avant l’étape de qPCR.
Parmi les 8 miARN examinés, miR-122, miR-133 a et miR-192 étaient détectables sans pré-amplification, tandis que miR-1 et miR-206 miR-499 a requis pré-amplification à cause de leur taux d’expression faible. MiR-208 a et 208 miR-b n’étaient pas détectables même après préamplification. Efficacité de traitement d’échantillon a été évaluée par les valeurs de Cq de la cel-miR-238 enrichis. Dans cette méthode de dosage, variation de la technique a été estimée à moins de 3 fois et la limite de quantification (PPQM) était 102 copie/µL, pour la plupart des miARN examinés.
Ce protocole prévoit une meilleure estimation de la quantité de plasma miARN et permet l’évaluation de la qualité des données correspondantes de différentes études. Compte tenu que du faible nombre des miARN dans les fluides corporels, préamplification est utile pour améliorer la détection du mal exprimé miARN.
Introduction
Un nombre croissant d’études ont été découverte de microARN (miARN) comme biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic des cancers, ou surveiller et détecter d’autres maladies dans les études cliniques et non cliniques1,2,3 . Quantitative en temps réel de transcription inverse PCR (RT-qPCR) est l’une des méthodes plus courantes utilisées pour évaluer les miARN cible individuelle, parce que cette technique est plus sensible que « microarray »4 et séquençage de RNA basant plates-formes5. En général, l’expression miRNA est mesurée par rapport à un échantillon de référence à l’aide de la méthode de ΔCq6. Cette approche est appropriée pour enquêter sur les changements physiologiques chez les taux d’expression de gènes cibles. Cependant, quantification relative des miARN en circulation a une utilité limitée en raison de leurs faibles quantités. En outre, variation de la technique rend difficile de comparer les résultats de différentes études, parce que différents laboratoires personnaliser les protocoles expérimentaux de la RT-qPCR différemment, ce qui conduit à incompatible ou contradictoire même résulte de différentes études7.
Compte tenu des préoccupations mentionnées ci-dessus, la quantification absolue pourrait être plus appropriée pour l’évaluation des petites quantités des miARN dans les fluides corporels. La méthode de quantification absolue utilise une courbe standard générée à partir des concentrations connues d’oligonucléotides synthétiques de RNA qui sont identiques dans l’ordre à la cible correspondante miRNA8. La santé et la Environmental Sciences Institute (HESI) Comité technique sur la génomique a récemment mené des études approfondies afin de comparer les résultats des mesures absolues de plasma miARN, sur plusieurs sites de test. Les résultats ont montré qu’en utilisant un protocole standard pour la quantification absolue des miARN ont donné des résultats comparables à travers les multiples test sites9. La méthode de dosage de RT-qPCR décrite dans la présente étude est presque identique au protocole standard de l’HESI, qui inclut une analyse multiplexée de multiples cibles miRNA et préamplification pour faciliter la détection des miARN faible expression.
Dans cette étude, un volume fixe (200 µL) de plasma EDTA-préparé à partir du sang prélevé de la veine fémorale commune des singes cynomolgus consciente (n = 50) a été utilisé10. Le protocole suivant décrit la procédure pour la préparation des échantillons de plasma, extraction de miRNA et RT-qPCR, y compris de pré-amplification. Plus important encore, des informations techniques supplémentaires sur le protocole a été incluses, afin que la quantité des miARN cible dans les échantillons peut être validée en combinaison avec un processus hautement qualifié. Tout d’abord, la courbe d’étalonnage de chaque miRNA a été validée pour sa gamme de détection individuels, avant sa quantification dans des échantillons biologiques. En second lieu, la qualité de la méthodologie actuelle a été complètement évaluée au moyen d’un contrôle externe (cel-miR-238), les valeurs de Cq. Par conséquent, cette plate-forme de rendements plus informatives et fiables des données permettant de comparer les résultats des différentes études ou laboratoires.
Les profils de 8 miARN ont été incluses dans le présent rapport comme résultats représentatifs de la méthode d’essai décrite ici. Ces miARN ont été proposés comme biomarqueurs potentiels de sécurité associées aux lésions au foie (miR-122 et miR-192), coeur (miR-1, miR-208, miR-208 et miR-499 a) et le muscle squelettique (miR-133 a et miR-206) chez les rongeurs et les humains3, 11,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre évaluation globale a fourni une analyse statistique plus rigoureuse de l’étendue de la gamme dynamique, qui indique clairement que l’ampleur de la variation entre les échantillons individuels était extrêmement différent parmi les miARN testé. Bien que ces variations peuvent être attribuables à leurs petites quantités dans les fluides corporels, il convient de noter que ces données reflètent non seulement des variations biologiques, mais aussi des variantes techniques. La plupart de la variation de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche n’a pas reçu une subvention spécifique de bailleurs de fonds dans les secteurs publics, de commerciale ou à but non lucratif.
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?–The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson’s disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
