Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화
Summary
이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.
Abstract
실시간 정량 Pcr 개별 대상 miRNAs 평가 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. MiRNAs 수준 일반적으로 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 더 나은 통계 분석을 사용 하 여 절대 정량화 유전자 식 레벨의 포괄적인 평가 위해 바람직합니다. 절대 부 량은 여전히 공통 사용 하지. 이 보고서 또는 사전 증폭 없이 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.
EDTA 플라스마의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 된 혈액에서 준비 되었다 (n = 50). 총 RNA는 상업적으로 사용 가능한 시스템을 사용 하 여 추출 되었다. 플라즈마 miRNAs는 프로브 기반 실시간 정량 Pcr 분석 실험 미르 관련 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 프로브를 포함 하 여 정량 했다. 절대 정량화에 대 한 표준 곡선 상용 합성 RNA oligonucleotides를 사용 하 여 생성 되었다. 합성 cel-미르-238 표준화 및 품질 평가 대 한 외부 제어로 사용 되었다. MiRNAs는 정량화 35 위 주기 (Cq) 값 정량 단계 전에 미리 증폭 했다.
가운데 8 miRNAs 검사, 미르-122, 미르-133a, 및 미르-192 했다 사전 증폭 없이 감지 미르-1, 미르-206, 그리고 미르-499a 그들의 낮은 식 수준 때문에 사전 확대를 요구 하는 반면. 미르-208a와 미르 208b 했다 감지 전 확대 후에. 샘플 처리 효율 아군된 cel-미르-238의 Cq 값에 의해 평가 되었다. 이 분석 방법에서 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다 하 고 정량화 (LLOQ)의 하한값은 102 복사 / µ L, 시험된 miRNAs의 대부분을 위해.
이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 견적을 제공 하 고 다른 연구에서 해당 하는 데이터의 품질 평가 허용 한다. 체액, 사전 증폭 miRNAs의 낮은 수는 저조한의 탐지를 향상 시키기 위해 유용 고려 miRNAs 표현.
Introduction
연구의 증가 진단 및 암의 예 후에 대 한 생체로 microRNAs (miRNAs)를 탐험 또는 모니터링 및 nonclinical 및 임상 연구1,2,3에에서 다른 질병을 감지 . 양이 많은 실시간 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량)이이 기술은 microarray4 와 RNA 시퀀싱 플랫폼5기반 보다 더 중요 한 있기 때문에 개별 대상 miRNAs, 평가 하는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 일반적으로, 미르 식6의 ΔCq 메서드 사용 하 여 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 순환 miRNAs의 상대 부 량 그들의 소량 때문에 유틸리티를 제한 했다. 또한, 기술 변형 하기가 다른 실험실 사용자 정의 실시간 정량 Pcr 실험 프로토콜 다르게, 일관성에 이르게 하거나 심지어 모순에서 결과 때문에 다른 연구에서 결과 비교 하기 어려운 다른 연구7.
위에서 언급 한 문제에 비추어 절대 정량화는 더 작은 양의 체액에서 miRNAs의 평가 적합 수 있습니다. 절대 정량화 방법은 해당 대상 미르8의 시퀀스와 동일한 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도에서 생성 된 표준 곡선을 사용 합니다. 건강과 환경 과학 연구소 (HESI) 유전체학 회 최근 여러 테스트 사이트에서 플라즈마 miRNAs의 절대 측정의 결과 비교 하는 포괄적인 연구를 실시 했다. 결과 여러 테스트 사이트9에서 유사한 결과 굴복 miRNAs의 절대 정량에 대 한 표준 프로토콜을 사용 하 여 보였다. 현재 연구에서 설명 하는 실시간 정량 분석 방법을 거의 여러 miRNA 표적, 및 낮은 식 miRNAs의 검색을 돕기 위해 사전 증폭의 다중화 분석 포함 HESI의 표준 프로토콜.
이 연구에서 EDTA-혈장 혈액에서 준비의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 (n = 50) 사용10. 다음과 같은 프로토콜의 추출, miRNA 및 RT-정량, 사전 증폭을 포함 하 여 플라즈마 샘플의 준비를 위한 절차를 설명 합니다. 샘플에서 대상 miRNAs의 수량 충분 한 자격이 프로세스와 함께에서 유효성을 검사할 수 있도록 더 중요 하 게는 프로토콜에 대 한 추가 기술 정보 포함 되었습니다. 첫째, 각 미르의 표준 곡선 생물학 견본에서 그것의 부 량 이전의 개별 검색 범위에 대 한 유효성을 검사 했다. 둘째, 현재 방법론의 품질 외부 컨트롤 (cel-미르-238)의 Cq 값에 의해 종합적으로 평가 되었습니다. 따라서,이 플랫폼은 다른 연구 나 실험실에서 결과 비교 하기 위한 더 유익 하 고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 합니다.
8 miRNAs의 프로필 대표 결과로이 보고서에 포함 된 시험 방법을 여기에 설명 된에서. 이러한 miRNAs (미르-1, 미르 208a, 미르-208b, 그리고 미르-499a), 심장 및 골격 근육 (133a 미르와 미르-206) 설치류와 인간3, 잠재적인 안전 생체 (122 미르와 미르-192), 간 조직 상해와 관련 된으로 제안 되어 11,,1213.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 포괄적인 평가 개별 샘플 사이 변이의 크기는 매우 다른 miRNAs 테스트 중 명확 하 게 표시 동적 범위의 넓이의 더 엄격한 통계 분석을 제공 합니다. 비록 이러한 유사 체액에 그들의 작은 수량에 기인 수 있습니다, 생물학 변화 뿐만 아니라 기술 변화 반영 하는 이러한 데이터 주목 해야한다. 기술 변화의 대부분은 다른 분석 결과 플랫폼18에서 사용 되는 외부 제어 (cel-미르-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 공공, 상업, 또는 하지-위한-비영리 부문에 자금 지원 기관에서 어떤 특정 그랜트를 받지 않았다.
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?–The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson’s disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
