Summary

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

Published: February 12, 2018
doi:

Summary

Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR gebruiken met of zonder voorafgaande versterking. Dit protocol biedt een beter begrip van de hoeveelheid plasma miRNAs en laat de kwalitatieve beoordeling van de bijbehorende gegevens uit verschillende studies of laboratoria.

Abstract

RT-qPCR is een van de meest voorkomende methoden voor de beoordeling van de individuele doelstelling miRNAs. MiRNAs over het algemeen gemeten ten opzichte van een referentie-exemplaar. Deze aanpak is geschikt voor de behandeling van fysiologische veranderingen in gen expressie streefniveau. Absolute kwantificering met behulp van betere statistische analyse is echter een uitgebreide beoordeling van gen expressie niveau de voorkeur verdient. Absolute kwantificering is nog steeds niet gemeen gebruiken. Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, met behulp van RT-qPCR met of zonder voorafgaande versterking.

Een vast volume (200 µL) van de EDTA-plasma bereid was uit het bloed verkregen van de femorale ader van bewuste cynomolgus apen (n = 50). Totaal RNA is geëxtraheerd met behulp van commercieel verkrijgbare systeem. Plasma miRNAs werden gekwantificeerd door de sonde gebaseerde RT-qPCR testen waarin miRNA-specifieke vooruit-/ achteruitspoelen PCR primers en sonde. Standaard curven voor absolute kwantificering werden gegenereerd met behulp van commercieel verkrijgbare synthetische oligonucleotides van RNA. Een synthetische cel-miR-238 werd gebruikt als een externe regelfunctie voor normalisatie en kwaliteit beoordeling. De miRNAs die kwantificering cyclus (Cq) waarden boven 35 toonde waren vooraf versterkte voorafgaand aan de qPCR stap.

Onder de 8 miRNAs onderzocht, waren miR-122, miR-133a en miR-192 detecteerbare zonder voorafgaande versterking, terwijl miR-1, miR-206 en miR-499a pre amplificatie vanwege hun lage expressie niveaus vereiste. MiR-208bis en miR-208b waren niet aantoonbaar zelfs na pre versterking. Monster verwerking efficiëntie werd beoordeeld door de Cq-waarden van de puntige cel-miR-238. Bij deze methode assay technische variatie werd geschat op minder dan 3-voudig en de ondergrens van kwantificering (Ondergrens) was 102 kopie/µL, voor de meeste van de onderzochte miRNAs.

Dit protocol biedt een betere schatting van de hoeveelheid plasma miRNAs, en kwaliteitsbeoordeling van de overeenkomstige gegevens van verschillende studies. Gelet op dat het geringe aantal miRNAs in lichaamsvloeistoffen, pre versterking is nuttig ter verbetering van de opsporing van slecht uitgedrukt miRNAs.

Introduction

Een toenemend aantal studies zijn het verkennen van microRNAs (miRNAs) als biomarkers voor de diagnose en prognose van kanker, of controle en opsporen van andere ziekten in nonclinical en klinische studies1,2,3 . Kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR (RT-qPCR) is één van de meest voorkomende methoden gebruikt ter beoordeling van de individuele doelstelling miRNAs, omdat deze techniek gevoeliger is dan microarray4 en RNA sequencing platformen5 gebaseerde. In het algemeen, wordt miRNA expressie gemeten ten opzichte van een referentie-exemplaar met behulp van de ΔCq methode6. Deze aanpak is geschikt voor het onderzoek van fysiologische veranderingen in gen expressie streefniveau. Relatieve kwantificering van de circulerende miRNAs heeft echter hulpprogramma beperkte vanwege hun kleine hoeveelheden. Daarnaast, maakt technische variatie het moeilijk te vergelijken van de resultaten van verschillende studies, omdat verschillende laboratoria de RT-qPCR experimentele protocollen anders aanpassen, wat leidt tot een inconsistente of zelfs tegenstrijdige van resultaten verschillende studies7.

Met het oog op de hierboven genoemde bezorgdheid, wellicht absolute kwantificering meer geschikt voor de beoordeling van de kleine hoeveelheden miRNAs in lichaamsvloeistoffen. De absolute kwantificering methode gebruikt een standaard curve gegenereerd op basis van bekende concentraties van synthetische oligonucleotides van RNA die identiek in volgorde aan de bijbehorende doelstelling miRNA8 zijn. De gezondheid en het milieu Sciences Institute (HESI) technisch comité op Genomics onlangs uitgevoerde uitgebreide studies te vergelijken van de resultaten van absolute metingen van plasma miRNAs, op meerdere test sites. De resultaten toonden aan dat met behulp van een standaardprotocol voor de absolute kwantificatie van miRNAs vergelijkbare resultaten opgeleverd in de test op meerdere sites9. De RT-qPCR assay methode beschreven in de huidige studie is vrijwel identiek aan het standaard protocol van de HESI, waaronder multiplexed analyse van meerdere miRNA doelen en pre versterking op de steun van de opsporing van lage expressie miRNAs.

In deze studie, een vast volume (200 µL) van de EDTA-plasma bereid uit het bloed verkregen van de femorale ader van bewuste cynomolgus apen (n = 50) gebruikte10was. Het volgende protocol beschrijft de methode voor de bereiding van de monsters van de plasma, winning van miRNA en RT-qPCR, met inbegrip van pre versterking. Wat nog belangrijker is, is aanvullende technische informatie over het protocol opgenomen, zodat de hoeveelheid doel miRNAs in de monsters kan worden gevalideerd in combinatie met een goed opgeleide proces. Eerst was de standaard curve van elke miRNA gevalideerd voor haar individuele registratiebereik, voorafgaand aan de kwantificering in biologische monsters. Ten tweede, de kwaliteit van de huidige methodiek werd uitvoerig geëvalueerd door middel van Cq waarden van een externe regelfunctie (cel-miR-238). Daarom levert dit platform meer informatieve en betrouwbare gegevens voor het vergelijken van de resultaten van verschillende studies of laboratoria.

De profielen van de 8 miRNAs in dit verslag zijn opgenomen als representatieve resultaten van de hier beschreven methode voor de bepaling. Deze miRNAs hebben voorgesteld als potentiële veiligheid biomarkers met weefsel schade aan de lever (miR-122 en miR-192), hart (miR-1, miR-208bis miR-208b en miR-499a), en skeletspieren (miR-133a en miR-206) in knaagdieren en de mens3geassocieerde, 11,12,13.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Daiichi Sankyo Co., Ltd. 1. de monstervoorbereiding Het verzamelen van bloed (ten minste 0,5 mL) van de femorale ader van cynomolgus apen in EDTA 2K-bevattende buizen.Opmerking: Citraat en heparine zijn niet aanvaardbaar omdat deze anticoagulantia latere PCR14,15 remmen. Leg de verzamelde monsters onmiddellijk op ijs e…

Representative Results

Workflow van miRNA assay door RT-qPCR en kwaliteit assessmentFiguur 1 toont de workflow van miRNA assay van bloedmonsters die met behulp van qPCR10. De kwaliteit van de experimenten kan worden geverifieerd door het opnemen van cel-miR-238 als een externe controle. Dit zal onthullen technische variaties in RNA extractie en de daaropvolgende RT-qPCR verwerkt. In deze studie was de gemiddelde ± SD van de Cq-…

Discussion

Onze uitgebreide beoordeling verstrekt een strengere statistische analyse van de omvang van het dynamisch bereik, die duidelijk aangegeven dat de omvang van variatie tussen de afzonderlijke monsters uiterst verschillende onder de miRNAs getest was. Hoewel deze variaties mogelijk toe te schrijven aan hun kleine hoeveelheden in lichaamsvloeistoffen, opgemerkt moet worden dat deze gegevens niet alleen biologische variaties, maar ook technische variaties weerspiegelen. Allermeest naar de technische variatie kan worden beoord…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek heeft specifieke subsidies niet ontvangen financieringsinstanties in de openbare, commerciële of not-for-profit sector.

Materials

BD Microtainer tube (K2EDTA) Becton, Dickinson and Company 365974 For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL Eppendorf 0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mL Eppendorf 0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mL Eppendorf 0030120094
Synthetic oligonucleotide Hokkaido System Science Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0) Nippon Gene 314-90021 TE buffer
Buffer RPE QIAGEN Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWT QIAGEN Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini Kit QIAGEN 217004
Nuclease-Free Water  QIAGEN 129114
QIAzol Lysis Reagent QIAGEN Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic  QIAGEN 219600 ID:MSY0000293, 5 nmol
SC Adapters TAIGEN Bioscience Corporation S0120 For RNA extraction
VacEZor 36 Complete System TAIGEN Bioscience Corporation M3610 For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific Inc. 4351405 Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700 Thermo Fisher Scientific Inc. 9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4311971
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific Inc. 4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit
Thermo Fisher Scientific Inc. 4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×) Thermo Fisher Scientific Inc. 4391128
Chloroform  Wako Pure Chemicals 035-02616
Ethanol (99.5) Wako Pure Chemicals 057-00456

References

  1. Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
  2. Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
  3. D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
  4. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
  5. Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
  6. Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
  7. Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?–The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
  8. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  9. Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
  10. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
  11. Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
  12. Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
  13. Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
  14. Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
  15. Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
  16. Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
  17. Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson’s disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
  18. Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
  19. Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
  20. Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
  21. Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
  22. Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
  23. Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
  24. Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
  25. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
  26. Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
  27. Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
  28. Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
check_url/kr/56850?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. J. Vis. Exp. (132), e56850, doi:10.3791/56850 (2018).

View Video