Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR gebruiken met of zonder voorafgaande versterking. Dit protocol biedt een beter begrip van de hoeveelheid plasma miRNAs en laat de kwalitatieve beoordeling van de bijbehorende gegevens uit verschillende studies of laboratoria.
RT-qPCR is een van de meest voorkomende methoden voor de beoordeling van de individuele doelstelling miRNAs. MiRNAs over het algemeen gemeten ten opzichte van een referentie-exemplaar. Deze aanpak is geschikt voor de behandeling van fysiologische veranderingen in gen expressie streefniveau. Absolute kwantificering met behulp van betere statistische analyse is echter een uitgebreide beoordeling van gen expressie niveau de voorkeur verdient. Absolute kwantificering is nog steeds niet gemeen gebruiken. Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, met behulp van RT-qPCR met of zonder voorafgaande versterking.
Een vast volume (200 µL) van de EDTA-plasma bereid was uit het bloed verkregen van de femorale ader van bewuste cynomolgus apen (n = 50). Totaal RNA is geëxtraheerd met behulp van commercieel verkrijgbare systeem. Plasma miRNAs werden gekwantificeerd door de sonde gebaseerde RT-qPCR testen waarin miRNA-specifieke vooruit-/ achteruitspoelen PCR primers en sonde. Standaard curven voor absolute kwantificering werden gegenereerd met behulp van commercieel verkrijgbare synthetische oligonucleotides van RNA. Een synthetische cel-miR-238 werd gebruikt als een externe regelfunctie voor normalisatie en kwaliteit beoordeling. De miRNAs die kwantificering cyclus (Cq) waarden boven 35 toonde waren vooraf versterkte voorafgaand aan de qPCR stap.
Onder de 8 miRNAs onderzocht, waren miR-122, miR-133a en miR-192 detecteerbare zonder voorafgaande versterking, terwijl miR-1, miR-206 en miR-499a pre amplificatie vanwege hun lage expressie niveaus vereiste. MiR-208bis en miR-208b waren niet aantoonbaar zelfs na pre versterking. Monster verwerking efficiëntie werd beoordeeld door de Cq-waarden van de puntige cel-miR-238. Bij deze methode assay technische variatie werd geschat op minder dan 3-voudig en de ondergrens van kwantificering (Ondergrens) was 102 kopie/µL, voor de meeste van de onderzochte miRNAs.
Dit protocol biedt een betere schatting van de hoeveelheid plasma miRNAs, en kwaliteitsbeoordeling van de overeenkomstige gegevens van verschillende studies. Gelet op dat het geringe aantal miRNAs in lichaamsvloeistoffen, pre versterking is nuttig ter verbetering van de opsporing van slecht uitgedrukt miRNAs.
Een toenemend aantal studies zijn het verkennen van microRNAs (miRNAs) als biomarkers voor de diagnose en prognose van kanker, of controle en opsporen van andere ziekten in nonclinical en klinische studies1,2,3 . Kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR (RT-qPCR) is één van de meest voorkomende methoden gebruikt ter beoordeling van de individuele doelstelling miRNAs, omdat deze techniek gevoeliger is dan microarray4 en RNA sequencing platformen5 gebaseerde. In het algemeen, wordt miRNA expressie gemeten ten opzichte van een referentie-exemplaar met behulp van de ΔCq methode6. Deze aanpak is geschikt voor het onderzoek van fysiologische veranderingen in gen expressie streefniveau. Relatieve kwantificering van de circulerende miRNAs heeft echter hulpprogramma beperkte vanwege hun kleine hoeveelheden. Daarnaast, maakt technische variatie het moeilijk te vergelijken van de resultaten van verschillende studies, omdat verschillende laboratoria de RT-qPCR experimentele protocollen anders aanpassen, wat leidt tot een inconsistente of zelfs tegenstrijdige van resultaten verschillende studies7.
Met het oog op de hierboven genoemde bezorgdheid, wellicht absolute kwantificering meer geschikt voor de beoordeling van de kleine hoeveelheden miRNAs in lichaamsvloeistoffen. De absolute kwantificering methode gebruikt een standaard curve gegenereerd op basis van bekende concentraties van synthetische oligonucleotides van RNA die identiek in volgorde aan de bijbehorende doelstelling miRNA8 zijn. De gezondheid en het milieu Sciences Institute (HESI) technisch comité op Genomics onlangs uitgevoerde uitgebreide studies te vergelijken van de resultaten van absolute metingen van plasma miRNAs, op meerdere test sites. De resultaten toonden aan dat met behulp van een standaardprotocol voor de absolute kwantificatie van miRNAs vergelijkbare resultaten opgeleverd in de test op meerdere sites9. De RT-qPCR assay methode beschreven in de huidige studie is vrijwel identiek aan het standaard protocol van de HESI, waaronder multiplexed analyse van meerdere miRNA doelen en pre versterking op de steun van de opsporing van lage expressie miRNAs.
In deze studie, een vast volume (200 µL) van de EDTA-plasma bereid uit het bloed verkregen van de femorale ader van bewuste cynomolgus apen (n = 50) gebruikte10was. Het volgende protocol beschrijft de methode voor de bereiding van de monsters van de plasma, winning van miRNA en RT-qPCR, met inbegrip van pre versterking. Wat nog belangrijker is, is aanvullende technische informatie over het protocol opgenomen, zodat de hoeveelheid doel miRNAs in de monsters kan worden gevalideerd in combinatie met een goed opgeleide proces. Eerst was de standaard curve van elke miRNA gevalideerd voor haar individuele registratiebereik, voorafgaand aan de kwantificering in biologische monsters. Ten tweede, de kwaliteit van de huidige methodiek werd uitvoerig geëvalueerd door middel van Cq waarden van een externe regelfunctie (cel-miR-238). Daarom levert dit platform meer informatieve en betrouwbare gegevens voor het vergelijken van de resultaten van verschillende studies of laboratoria.
De profielen van de 8 miRNAs in dit verslag zijn opgenomen als representatieve resultaten van de hier beschreven methode voor de bepaling. Deze miRNAs hebben voorgesteld als potentiële veiligheid biomarkers met weefsel schade aan de lever (miR-122 en miR-192), hart (miR-1, miR-208bis miR-208b en miR-499a), en skeletspieren (miR-133a en miR-206) in knaagdieren en de mens3geassocieerde, 11,12,13.
Onze uitgebreide beoordeling verstrekt een strengere statistische analyse van de omvang van het dynamisch bereik, die duidelijk aangegeven dat de omvang van variatie tussen de afzonderlijke monsters uiterst verschillende onder de miRNAs getest was. Hoewel deze variaties mogelijk toe te schrijven aan hun kleine hoeveelheden in lichaamsvloeistoffen, opgemerkt moet worden dat deze gegevens niet alleen biologische variaties, maar ook technische variaties weerspiegelen. Allermeest naar de technische variatie kan worden beoord…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek heeft specifieke subsidies niet ontvangen financieringsinstanties in de openbare, commerciële of not-for-profit sector.
BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |