Summary

Absolutt kvantifisering av Plasma MicroRNA i Cynomolgus aper, ved hjelp av kvantitative sanntid omvendt transkripsjon PCR

Published: February 12, 2018
doi:

Summary

Denne rapporten beskriver en protokoll for å måle de absolutte nivåene av plasma miRNA, bruker kvantitative sanntid omvendt transkripsjon PCR med eller uten pre forsterkning. Denne protokollen gir bedre forståelse av mengden av plasma miRNAs og lar kvalitativ vurdering av tilsvarende data fra forskjellige studier eller laboratorier.

Abstract

RT-qPCR er en av de vanligste metodene for å vurdere personlige mål miRNAs. MiRNAs nivåer er vanligvis målt i forhold til en referanse-prøve. Denne tilnærmingen er egnet for å undersøke fysiologiske endringer i målet gene expression nivåer. Absolutt kvantifisering bedre statistisk analyse er imidlertid å foretrekke for en helhetlig vurdering av gene expression nivåer. Absolutt kvantifisering er ikke fortsatt i vanlig bruk. Denne rapporten beskriver en protokoll for å måle de absolutte nivåene av plasma miRNA, bruker RT-qPCR med eller uten pre forsterkning.

Et fast volum (200 µL) av EDTA-plasma var forberedt fra blodet fra femur åre bevisst cynomolgus aper (n = 50). Totalt RNA ble hentet ved hjelp av kommersielt tilgjengelig system. Plasma miRNAs kvantifisert av sonden-baserte RT-qPCR analyser som inneholder miRNA-spesifikke forover/bakover PCR primer og sonde. Standard kurver for absolutt kvantifisering ble generert ved hjelp av kommersielt tilgjengelige syntetiske RNA-oligonucleotides. En syntetisk cel-miR-238 ble brukt som en ekstern kontroll for normalisering og kvalitet vurdering. MiRNAs som viste kvantifisering syklus (Cq) verdier over 35 var pre forsterket før qPCR trinnet.

Blant de 8 miRNAs undersøkt, var miR-122 og miR 133a, miR-192 synlig uten pre forsterkning, mens miR-1, miR-206 og miR-499a kreves før forsterkning på grunn av sin lave uttrykk nivåer. MiR-208a og miR-208b var ikke synlig selv etter pre forsterkning. Eksempel opparbeidningen effektiv ble evaluert av Cq verdiene til piggete cel-miR-238. I denne analysen metoden, teknisk variant var anslått til å være mindre enn 3 ganger og den laveste grensen for kvantifisering (LLOQ) var 102 kopi/µL, for det meste av det undersøkt miRNAs.

Denne protokollen gir et bedre estimat over mengden av plasma miRNAs, og tillater kvalitetsvurdering av tilsvarende data fra forskjellige studier. Vurderer det lave antallet miRNAs i kroppsvæsker, pre forsterkning er nyttig å forbedre gjenkjenning av dårlig uttrykt miRNAs.

Introduction

Et økende antall studier har vært å utforske microRNAs (miRNAs) som biomarkers for diagnose og prognose av kreft, eller overvåking og oppdage andre sykdommer i nonclinical og kliniske studier1,2,3 . Kvantitativ sanntid omvendt transkripsjon PCR (RT-qPCR) er en av de vanligste metodene brukes til å vurdere personlige mål miRNAs, fordi denne teknikken er mer følsom enn microarray4 og RNA sekvensering basert plattformer5. Generelt måles miRNA uttrykk i forhold til en referanse prøve bruker ΔCq metode6. Denne tilnærmingen er egnet for å undersøke fysiologiske endringer i målet gene expression nivåer. Relativ kvantifisering av sirkulerende miRNAs har imidlertid begrenset nytte på grunn av deres små mengder. I tillegg gjør tekniske variasjon det vanskelig å sammenligne resultatene fra forskjellige studier, fordi ulike laboratorier tilpasse RT-qPCR eksperimentelle protokollene annerledes, som fører til strid eller med motstridende resultater fra forskjellige studier7.

I lys av bekymringene nevnt, kan absolutt kvantifisering være mer egnet for vurdering av små mengder av miRNAs i kroppsvæsker. Den absolutte kvantifisering metoden bruker en standardkurve generert fra kjente konsentrasjoner av syntetiske RNA-oligonucleotides som er identisk i rekkefølge til tilsvarende målet miRNA8. Helse- og miljømessige Sciences Institute (HESI) teknisk komité for Genomics nylig gjennomført omfattende studier for å sammenligne resultatene av absolutt målinger av plasma miRNAs, på tvers av flere test nettsteder. Resultatene viste at ved hjelp av en standardprotokoll for absolutt kvantifisering av miRNAs gitt sammenlignbare resultater på tvers av flere test nettsteder9. RT-qPCR analysen metoden beskrevet studien er nesten identisk med den HESI standard-protokoll, som inkluderer multiplex analyse av flere miRNA mål og pre forsterkning å hjelpe oppdagelsen av lav uttrykket miRNAs.

I denne studien samlet et fast volum (200 µL) av EDTA-plasma forberedt fra blodet fra femur åre bevisst cynomolgus aper (n = 50) var brukte10. Følgende protokollen beskriver fremgangsmåten for utarbeidelse av plasmaprøver, utvinning av miRNA og RT-qPCR, inkludert pre forsterkning. Enda viktigere, har hvis du vil ha mer teknisk informasjon om protokollen vært inkludert, slik at antall mål miRNAs i utvalgene kan valideres i kombinasjon med en godt kvalifisert prosess. Først ble standardkurven av hver miRNA godkjent for sin personlige rekkevidde, før sin kvantifisering i biologiske prøver. Andre ble kvaliteten på den gjeldende metodikken grundig vurdert gjennom Cq verdier av en ekstern kontroll (cel-miR-238). Derfor gir denne plattformen mer informativ og pålitelige data for å sammenligne resultatene fra forskjellige studier eller laboratorier.

Profiler av 8 miRNAs er inkludert i denne rapporten som representant resultatene fra analysen metoden beskrevet her. Disse miRNAs er foreslått som mulige sikkerhet biomarkers tilknyttet vev skade leveren (miR-122 og miR-192), hjerte (miR-1, miR 208a, miR-208b og miR-499a) og skjelettlidelser muskel (miR-133a og miR-206) i gnagere og mennesker3, 11,12,13.

Protocol

Alle eksperimentene ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Daiichi Sankyo co, Ltd 1. sample forberedelse Samle blod (minst 0,5 mL) fra femur åre cynomolgus apekatter i EDTA 2K inneholder rør.Merk: Citrate og heparin aksepteres ikke fordi disse antikoagulanter hemme påfølgende PCR14,15. Plass de innsamlede eksemplene umiddelbart på isen og prosess for plasma isolasjon innen 2 timer e…

Representative Results

Arbeidsflyt miRNA analysen av RT-qPCR og kvalitet assessmentFigur 1 viser arbeidsflyten miRNA analysen fra blodprøver som bruker qPCR10. Kvaliteten av eksperimenter kan verifiseres ved å inkludere cel-miR-238 som en ekstern kontroll. Dette vil avdekke tekniske variasjoner i RNA utvinning og påfølgende RT-qPCR prosesser. I denne studien var gjennomsnittlig ± SD Cq verdiene beregnet fra 50 prøver 21.0 …

Discussion

Vår omfattende vurdering gitt en strengere statistisk analyse av omfanget av det dynamiske området, som klart indikerte at omfanget av variasjon mellom individuelle prøvene var svært forskjellige blant miRNAs testet. Selv om disse variasjonene kan være knyttet til deres små mengder i kroppsvæsker, bør det bemerkes at disse dataene gjenspeiler ikke bare biologiske varianter, men også teknisk varianter. De fleste av tekniske variasjonen kan vurderes ved Cq verdiene til eksterne kontrollen (cel-miR-238), som brukes…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen mottok ikke noen bestemt grant fra virkemiddelaktører innen offentlig, kommersielle eller ikke-for-profit.

Materials

BD Microtainer tube (K2EDTA) Becton, Dickinson and Company 365974 For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL Eppendorf 0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mL Eppendorf 0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mL Eppendorf 0030120094
Synthetic oligonucleotide Hokkaido System Science Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0) Nippon Gene 314-90021 TE buffer
Buffer RPE QIAGEN Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWT QIAGEN Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini Kit QIAGEN 217004
Nuclease-Free Water  QIAGEN 129114
QIAzol Lysis Reagent QIAGEN Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic  QIAGEN 219600 ID:MSY0000293, 5 nmol
SC Adapters TAIGEN Bioscience Corporation S0120 For RNA extraction
VacEZor 36 Complete System TAIGEN Bioscience Corporation M3610 For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific Inc. 4351405 Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700 Thermo Fisher Scientific Inc. 9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4311971
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific Inc. 4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit
Thermo Fisher Scientific Inc. 4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×) Thermo Fisher Scientific Inc. 4391128
Chloroform  Wako Pure Chemicals 035-02616
Ethanol (99.5) Wako Pure Chemicals 057-00456

References

  1. Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
  2. Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
  3. D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
  4. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
  5. Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
  6. Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
  7. Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?–The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
  8. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  9. Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
  10. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
  11. Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
  12. Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
  13. Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
  14. Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
  15. Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
  16. Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
  17. Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson’s disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
  18. Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
  19. Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
  20. Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
  21. Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
  22. Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
  23. Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
  24. Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
  25. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
  26. Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
  27. Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
  28. Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
check_url/kr/56850?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. J. Vis. Exp. (132), e56850, doi:10.3791/56850 (2018).

View Video