変形能と赤血球による血液中赤血球の不均一性を測定
Summary
赤血球赤血球変形能と細胞の不均一性を測定する技術をご紹介します。これらのテクニックは、赤血球変形能の一般的な調査および鎌状細胞貧血症などの循環の両方の剛性と変形赤血球の存在によって特徴づけられる血液の疾患の特定の調査に適用されます。
Abstract
減少した赤血球変形能は、いくつかの疾患の特徴です。いくつかのケースで欠陥のある変形の程度は疾患の重症度や重篤な合併症の発生を予測できます。赤血球を使用してレーザー回折粘度測定増加せん断応力やせん断応力の定数値で浸透圧勾配の対象と赤血球の変形能を測定します。ただし、直接変形測定が両方の剛性と変形赤血球の存在によって特徴付けられる異種血を測定する場合の解釈が難しい。これは剪断応力および明白な変形の誇張された減少によって特徴づけられる歪んだ回折パターンで結果に応答を正しく合わせるという堅い細胞ができないのためにです。歪み度の測定は、血液中の赤血球の不均一性の指標を提供します。鎌状赤血球貧血でヘモグロビン濃度と赤血球のヘモグロビン合成を反映する堅い細胞の割合と相関しているこれ。変形能を測定するだけでなく浸透圧勾配赤血球浸透圧脆弱性と赤血球の水和状態に関する情報を提供します。これらのパラメーターは、鎌状赤血球の患者の赤い血球のヘモグロビン組成も反映されます。赤血球は赤血球の変形能を測定し、そのため、情報を提供しない変形または個々 の赤血球の機械的性質。関係なく、記載方法の目的は、変形と血液の細胞の不均一性を測定する便利で信頼できる方法を提供します。これらの技術は、一時的な変更と同様、病気の進行といくつかの疾患の治療への応答を監視するために役立ちます。鎌状赤血球貧血は、1 つのよ特徴付けられた例です。血の記憶域、糖尿病、マラリア原虫感染症、鉄欠乏、および膜欠陥による溶血性貧血、赤血球変形能や不均一性の測定が関心のある他の潜在的な疾患が含まれます。
Introduction
赤血球は、赤血球変形能せん断応力 (パスカル (Pa) 単位) や中断中の浸透圧の変化への応答の便利な測定を提供します。赤血球変形能の関連パラメーターは、最大伸長インデックス (EI 最大)、(SS ½) 増加のせん断応力とせん断応力 ½ への応答の赤いセルの最大変形能の測定、半分の最大を達成するために必要な剪断応力変形。1浸透圧勾配赤血球有益ないくつかのパラメーターがあります。最低伸びインデックス (EI 分)、表面・体積比の測定 (O 分) を発生する浸透圧などのこれら浸透圧脆弱性の尺度であります。EI Max と (O (EI マックス)) が発生した浸透圧膜の柔軟性とセル面積に関する情報を提供します。浸透圧勾配の高張の腕の半分の最大伸長は、EI ハイパーで表されます。ハイパー EI と浸透圧で発生した O ハイパー、ヘモグロビン濃度によって決定される赤血球の細胞内の粘度についての情報を提供します。2,3異種血液測定変形能は sickled 赤血球など、硬質のセルは正しくなどの剪断応力の増加への応答変形細胞の流れの方向と一致しないという事実によって複雑になります。特徴的な楕円形回折画像を生成ではなく剛細胞は、ダイヤモンド形回折パターン変形細胞によって生成される楕円に重ねたとき、球状パターンを生成します。4,5,6密度遠心分離の後で細胞の隔離された分画に赤血球を実行することによって不可逆的 sickled のセルに対応する球状のパターンが示されています。6 には伸び指数計算には、楕円のロングとショートの両方の軸の対策が含まれますダイヤモンドの形は、したがって短い軸の幅を増やすことで伸長量の明白な減少を生成します。7以前使用されている回折パターン歪みの度合いは鎌状ヘモグロビン (HbS) の割合と鎌状赤血球貧血患者から血液中の sickled 細胞の割合と相関していること。5回折パターン歪みの度合いは、複雑な数学的な分析によって取得できます。8それもすることによって、ektacytometer のカメラの絞りの開口部や回折パターンの高さを変更する継ぎ手ソフトウェアの灰色レベルを調整します。5灰色のレベルを調整する方法についての詳細はよく定義されていませんし、市販の ektacytometer の最新世代のカメラの絞り値は容易にアクセスできません。これらの問題を回避するために簡単にアクセスできるカメラのゲインを使用して回折パターンの高さを調整できます。9細胞異質性を推定するこのメソッドを使用して、回折パターン歪みの度合いは鎌状細胞貧血症の患者の血中の胎児のヘモグロビンの割合と関連付けることができます。10は浸透圧勾配赤血球パラメーターがいくつか、胎児の割合と相関同様に鎌鎌状細胞貧血症の患者の血液中のヘモグロビンや。回折パターン歪みの相関関係は、剛性、非変形細胞の割合にヘモグロビン組成の貢献度を反映しています。追加の関心は、全体の浸透圧勾配赤血球プロファイルは鎌状細胞の危機の間に循環の密な細胞の割合に対応する相性変化を受けます。11
赤血球は、同様に他のいくつかの疾患の研究に役立ちます。浸透圧勾配赤血球は継承された赤細胞の膜障害、遺伝性球状赤血球症、遺伝性 elliptocytosis 遺伝性 pyropoikilocytosis などの診断です。3,12,13,14鉄欠乏性減少変形が発生します。15血の「ストレージ病変」の特性は赤血球と病変の両方の性質を調べて今後研究を採用している、バンク血液の貯蔵の間にその形成を防ぐために介入から利益を得る可能性が高い、ここで紹介する手法。16減少赤血球変形能と糖尿病の血管疾患とも相関しています。17最近の研究高血糖をリンク、赤血球アスコルビン酸濃度と浸透圧脆弱性示唆これらの要因は血管疾患の開発に重要かもしれない。18赤血球の研究が現在進行中であるこの仮説を調査する (プロセスとレヴァイン、未発表のデータ)。血段階マラリア感染は、赤血球変形能調査の別の興味深い通りです。熱帯熱マラリア原虫の細胞の変形性感染シゾントにリング段階から寄生虫の細胞成熟の 48 時間の間に劇的に赤の血液細胞が減少します。証拠は、この減らされた変形は寄生虫の成熟の時に逆にことを示します。逆転は循環に感染した赤血球のリリースと一致します。減らされた変形は、赤血球の貯留を促進するマラリア原虫蛋白質によって仲介されると考えられます。19これらの研究は、赤血球変形能の測定および浸透圧勾配パラメーターが関連する臨床的に重要な条件の一部を表しています。研究のいくつかの追加エリアが存在します。
赤血球の変形能を測定するための代替技術には、光子の物理的なプロパティを使用して、1 つまたは複数の方向の単一の赤い細胞を伸ばす光ピンセット (レーザー トラップとも呼ばれます) が含まれます。20この手法が単一の赤血球の変形能を測定の利点が力調整のいくつかの不確実性は、研究21間でかなり変動を生産しているし、データ分析労力を必要としない限り、自動化されています。22マイクロ ピペット吸引負圧を使用して、マイクロ ピペットに赤血球を吸引するは赤血球の変形能を測定するためにも使用されています。7,23赤セルのさまざまな特性を定義する各メジャーの赤い細胞を吸引に必要な圧力など、複数の計測が可能です。23原子間力顕微鏡は、赤血球の表面に沿ってカンチレバーのたわみ量の指標としてレーザー ビーム偏向を定量化することで膜剛性を測定する高解像度技術。24これらの技術は個々 の赤血球に関する情報を提供、赤血球の個体数の変化を測定し、一般的には、かなりの技術的な専門知識を必要と簡単に適用されません。
同時に両方の個人やセルの人口をサンプルへの欲求は、オートメーションとマイクロ流体システムとアレイ ・ ベースの方法の開発の進歩につながっています。赤血球のような rheoscopy は、せん断応力の関数として変形を測定しますが、顕微鏡を通して直接画像を取得します。25高いスループット分析のため自動細胞イメージングは、平行円板型レオスコープを用いた変形分布を生成に採用されています。26携帯電話の不均一性は、健康な対照被験者からのデータが利用できる場合、このメソッドによって定量化します。27マイクロ流体技術では、単一セルの高スループット解析ろ過、28セル トランジット アナライザー、29 、細孔における赤血球流れに必要な時間を計測してむしろ赤血球通過に必要な圧力を測定する選択肢の適応を使用して複数の設計時間30よりも開発されています。個々 のセルの高スループット分析のための別のプラットフォームは、セルの下流の蛍光ベースの評価ができるという付加的な利点を持っている単一のセル マイクロチャンバ アレイ チップです。31 には赤血球の比較優位には: 各技術の役立つ可能性が、特定のアプリケーションに対して優位である可能性が、感度、操作性、精度が含まれています。32市販 ektacytometers の最新の世代はまた、実行できるアッセイの数のかなりの多様性を所有しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
簡単な説明赤血球手法は、よく自動で有効で再現性のある結果を確保します。それにもかかわらず、いくつかの重要な手順が存在します。血液の適切な温度管理が重要です。8 時間以上室温で保管 SS ½ に影響を与える可能性があります値。34機の温度は 37 ° C で安定確保も重要です、中断中の粘度は温度に依存。血液は、これらの興味の実験的パラメーターでない限り、非?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立研究所糖尿病、消化器・腎臓病、国立心臓、肺血国立衛生研究所の学内研究プログラムによって支えられました。意見が発現記載は作者の唯一の責任し、健康の国民の協会の公式の見解を必ずしも表さない。
Materials
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
References
- Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance. Blood. 61 (5), 899-910 (1983).
- Da Costa, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders: Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells Mol Dis. 56 (1), 9-22 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. J Clin Invest. 65 (1), 189-196 (1980).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Bessis, M., Mohandas, N. Laser Diffraction Patterns of Sickle Cells in Fluid Shear Fields. Blood Cells. 3, 229-239 (1977).
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y., Moschandreou, T. E. . Blood Cell – An Overview of Studies in Hematology. , (2012).
- Streekstra, G. J., Dobbe, J. G., Hoekstra, A. G. Quantification of the fraction poorly deformable red blood cells using ektacytometry. Opt Express. 18 (13), 14173-14182 (2010).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization for the ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2 in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells Mol Dis. 65, 41-50 (2017).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Johnson, R. M., Ravindranath, Y. Osmotic scan ektacytometry in clinical diagnosis. J Pediatr Hematol Oncol. 18 (2), 122-129 (1996).
- Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S., Shohet, S. B. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest. 66 (3), 563-573 (1980).
- Lazarova, E., Gulbis, B., Oirschot, B. V., van Wijk, R. Next-generation osmotic gradient ektacytometry for the diagnosis of hereditary spherocytosis: interlaboratory method validation and experience. Clin Chem Lab Med. 55 (3), 394-402 (2017).
- Anderson, C., Aronson, I., Jacobs, P. Erythrocyte Deformability is Reduced and Fragility increased by Iron Deficiency. Hematology. 4 (5), 457-460 (1999).
- Reinhart, W. H., et al. Washing stored red blood cells in an albumin solution improves their morphologic and hemorheologic properties. Transfusion. 55 (8), 1872-1881 (2015).
- Shin, S., et al. Progressive impairment of erythrocyte deformability as indicator of microangiopathy in type 2 diabetes mellitus. Clin Hemorheol Microcirc. 36 (3), 253-261 (2007).
- Tu, H., et al. Low Red Blood Cell Vitamin C Concentrations Induce Red Blood Cell Fragility: A Link to Diabetes Via Glucose, Glucose Transporters, and Dehydroascorbic Acid. EBioMedicine. 2 (11), 1735-1750 (2015).
- Tiburcio, M., et al. A switch in infected erythrocyte deformability at the maturation and blood circulation of Plasmodium falciparum transmission stages. Blood. 119 (24), e172-e180 (2012).
- Henon, S., Lenormand, G., Richert, A., Gallet, F. A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers. Biophys J. 76 (2), 1145-1151 (1999).
- Mills, J. P., Qie, L., Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers. Mech Chem Biosyst. 1 (3), 169-180 (2004).
- Moura, D. S., et al. Automatic real time evaluation of red blood cell elasticity by optical tweezers. Rev Sci Instrum. 86 (5), 053702 (2015).
- Evans, E. A. New membrane concept applied to the analysis of fluid shear- and micropipette-deformed red blood cells. Biophys J. 13 (9), 941-954 (1973).
- Chen, X., Feng, L., Jin, H., Feng, S., Yu, Y. Quantification of the erythrocyte deformability using atomic force microscopy: correlation study of the erythrocyte deformability with atomic force microscopy and hemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (3), 243-251 (2009).
- Musielak, M. Red blood cell-deformability measurement: review of techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (1), 47-64 (2009).
- Dobbe, J. G., Streekstra, G. J., Hardeman, M. R., Ince, C., Grimbergen, C. A. Measurement of the distribution of red blood cell deformability using an automated rheoscope. Cytometry. 50 (6), 313-325 (2002).
- Dobbe, J. G., et al. Analyzing red blood cell-deformability distributions. Blood Cells Mol Dis. 28 (3), 373-384 (2002).
- Kikuchi, Y., Arai, T., Koyama, T. Improved filtration method for red cell deformability measurement. Med Biol Eng Comput. 21 (3), 270-276 (1983).
- Moessmer, G., Meiselman, H. J. A new micropore filtration approach to the analysis of white cell rheology. Biorheology. 27 (6), 829-848 (1990).
- Guo, Q., et al. Microfluidic analysis of red blood cell deformability. J Biomech. 47 (8), 1767-1776 (2014).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Appl Phys Lett. 100 (17), 173702-173703 (2012).
- Baskurt, O. K., et al. Comparison of three commercially available ektacytometers with different shearing geometries. Biorheology. 46 (3), 251-264 (2009).
- Baskurt, O. K., et al. New guidelines for hemorheological laboratory techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (2), 75-97 (2009).
- Uyuklu, M., et al. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (4), 269-278 (2009).
- Uyuklu, M., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effect of hemoglobin oxygenation level on red blood cell deformability and aggregation parameters. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (3), 179-188 (2009).
- Embury, S. H., Clark, M. R., Monroy, G., Mohandas, N. Concurrent sickle cell anemia and alpha-thalassemia. Effect on pathological properties of sickle erythrocytes. J Clin Invest. 73 (1), 116-123 (1984).
- von Tempelhoff, G. F., et al. Correlation between blood rheological properties and red blood cell indices(MCH, MCV, MCHC) in healthy women. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (1), 45-54 (2016).
- Da Costa, L., Galimand, J., Fenneteau, O., Mohandas, N. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Rev. 27 (4), 167-178 (2013).
