طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس
Summary
الحصول على جودة عالية المجينية الحمض النووي من أنسجة الورم خطوة أولى أساسية لتحليل التعديلات الوراثية باستخدام تسلسل الجيل القادم. في هذه المقالة، نحن نقدم طريقة بسيطة وسريعة لإثراء الخلايا السرطانية والحصول على الحمض النووي سليمة من لمس بصمة عنق العينات.
Abstract
من المهم تحديد حالة حيث في السرطان قبل الإدارة والعلاج العقاقير المستهدفة جزيئية محددة لمرضى السرطان. في الإعداد السريرية، الفورمالين–الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة (FFPE) تستخدم على نطاق واسع للاختبارات الجينية. ومع ذلك، FFPE الحمض النووي عموما أضرار ومجزأة أثناء عملية التثبيت مع الفورمالين. ولذلك، “فب الحمض النووي” ليس أحياناً كافية للاختبارات الجينية بسبب تدني نوعية وكمية من الحمض النووي. هنا نقدم طريقة للمس بصمة علم الخلايا (عرة) للحصول على الحمض النووي من الخلايا السرطانية، التي يمكن ملاحظتها تحت مجهر. يمكن تقييم أرقام الخلية مورفولوجيا وسرطان الخلية باستخدام عينات عرة. وعلاوة على ذلك، استخراج الحمض النووي من عينات التشنج يمكن أن تكتمل في غضون يومين. وكان إجمالي كمية ونوعية من “عرة الحمض النووي” التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الأسلوب أعلى من “الحمض النووي فب”. يسمح هذا الأسلوب السريع والبسيط الباحثين للحصول على الحمض النووي عالي الجودة للاختبارات الجينية (مثلتحليل تسلسل الجيل القادم، بكر الرقمية والوقت الحقيقي الكمي PCR) وتقصير المدة اللازمة للإبلاغ عن النتائج.
Introduction
الجيل القادم تكنولوجيا التسلسل وقدم الباحثون أوجه التقدم الكبير في تحليل المعلومات الجينوم في الاختلافات الوراثية والأمراض مندلية والاستعداد الوراثي والسرطان 1،2،3 . أطلس جينوم السرطان (تكجا)، واتحاد جينوم السرطان الدولية (إيكجك) اتبعت تحديد التعديلات الوراثية في عدة أنواع من السرطانات الشائعة4. مئات جينات سائق السرطان الأساسية قد حددت بنجاح، وبعض هذه الجزيئات مستهدفون للمخدرات التنمية1،،من56.
في الإعداد السريرية، يشيع استخدام العينات FFPE المرضية التشخيص والاختبارات الجزيئية للأمراض المختلفة، بما في ذلك السرطان. ومع ذلك، أثناء عملية التثبيت مع الفورمالين، البروتين الحمض النووي أو الحمض الخلوي الصبغي DNA العابرة للربط يحدث وفعل تجزؤ الحمض النووي. وهكذا، عينات من “الحمض النووي فب” ليست دائماً مناسبة للتحليل الجيني بسبب تدني نوعية وكمية من الحمض النووي7،،من89. بالإضافة إلى ذلك، يستغرق عدة أيام لإعداد العينات فب، والمهارة التقنية اللازمة لإعداد دقة المقاطع. لذلك، من المستحسن لتطوير طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية سليمة الحمض النووي.
علم الخلايا طريقة بديلة لتشخيص المرضية. إعداد عينة الخلوية أبسط، أقل النهج باهظة الثمن، وأكثر سرعة بالمقارنة مع إعداد فب10. وقد أجريت تقنية تيك على الحارس الغدد الليمفاوية والأنسجة هامشية من مرضى سرطان الثدي للمضاعفات التشخيص السريع لبعض السنوات11،12. ومع ذلك، هناك عدد قليل من التقارير التي درست ما إذا كان يمكن استخراج الحمض النووي عالي الجودة من العينات عرة، وتستخدم للتحليل الجيني اللاحقة. عينات الخلوية عادة ملطخة بابانيكولاو (Pap) أو تلطيخ جيمسى، وكنا ذكرت سابقا أن كمية ونوعية من الحمض النووي المستخرج من عينات عرة (لا سيما العينات الملطخة جيمسى) تعلو على العينات التي تم الحصول عليها من فب 13من الأنسجة. وبالمقارنة مع تلطيخ Pap، تلطيخ Giemsa لديه ميزة التي تتطلب إجراءات المصبوغة أقل. في تلطيخ Pap، بعد أن تم إصلاح العينات والملون، يجب تحميل مع تصاعد المتوسطة (مثلاً، مالينول) للتمييز بين محتويات نموذج، مثل الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية والخلايا الملتهبة تحت مجهر. إذا كانت العينة Pap مستعدة دون خطوة متصاعدة، من المستحيل تقريبا لمراقبة الخلايا تحت مجهر لأن العينة هو المجففة. وبالمقارنة، تلطيخ Giemsa يمكن ملاحظتها في الدولة المجففة، ولذلك الخطوة تصاعد ليس ضروريا للتقييم السريع الخلوية. ميكروديسيكشن، جيمسى تلطيخ أكثر ملاءمة لأنها تتطلب العينات الجافة.
في هذا التقرير، علينا الأخذ بطريقة بسيطة وسريعة لإعداد العينات التشنج مع تلطيخ Giemsa وتثبت أن التشنج أفضل مصدر للحمض النووي مقارنة مع العينات فب.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، وقد عرضنا طريقة بديلة للحصول على الورم الحمض النووي من العينات المرضية السريرية استخدام عرة. إعداد عرة بسيطة جداً وتحتاج إلى وقت أقل بالمقارنة مع أساليب فب، دون الحاجة إلى أدوات خاصة10. يمكن إكمال كافة الإجراءات من إعداد عرة لاستخراج الحمض النووي في غضون يومين …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر جميع الموظفين الطبية والتبعية للمستشفى والمرضى لموافقتها على المشاركة. ونحن نشكر “غابرييل الأبيض وولف”، دكتوراه، من مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة لهذا التقرير. وأيد هذه الدراسة معونات “مشروع بحوث الجينوم” من محافظة ياماناشي (أي إتش ومو) ومنحة من ياسودا الطبية مؤسسة (أي إتش).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer – Three Strikes and You’re Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
- Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
- Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
- Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
- Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
- Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
- Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
- Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
- Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
- Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
- Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
- Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
- Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
- Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).
