Einfache und schnelle Methode, um qualitativ hochwertige Tumor DNA von klinischen pathologischen Proben mit Touch Impressum Zytologie zu erhalten
Summary
Erhalten qualitativ hochwertige genomischen DNA von Tumorgewebe ist ein wichtiger erster Schritt für die Analyse von genetischer Veränderungen, die Sequenzierung der nächsten Generation. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode, um Tumorzellen zu bereichern und intakte DNA von Touch Impressum Zytologische Proben erhalten.
Abstract
Es ist entscheidend für die Mutationszucht Status bei Krebs vor Verwaltung und Behandlung der spezifische molekulare zielgerichtete Medikamente für Krebspatienten zu bestimmen. In der klinischen Einstellung sind Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe für Gentests verbreitet. Proteinkinase DNA ist jedoch in der Regel beschädigt und bei der Fixierung mit Formalin fragmentiert. Proteinkinase DNA ist daher manchmal nicht ausreichend für die genetische Untersuchung wegen geringer Qualität und Quantität der DNA. Hier präsentieren wir eine Methode der Touch Impressum Zytologie (TIC), genomischen DNA von Krebszellen zu erhalten, die unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. Zelle Morphologie und Krebs-Zell-Zahlen können mit TIC Proben ausgewertet werden. Darüber hinaus kann die Extraktion von genomischer DNA aus TIC Proben innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden. Den Gesamtbetrag und die Qualität der TIC DNA erhalten mit dieser Methode war höher als die der Proteinkinase DNA. Diese schnelle und einfache Methode erlaubt Forschern, qualitativ hochwertige DNA für genetische Untersuchungen (z.B., nächste Generation Sequenzierung Analyse, digitale PCR und quantitative Real-Time PCR) zu erhalten und um die Bearbeitungszeit für die Berichterstattung über Ergebnisse zu verkürzen.
Introduction
Nächste Generation Sequencing Technologie hat Forscher erhebliche Fortschritte bei der Analyse von Genominformationen in genetischen Variationen, Mendelian Krankheit, erbliche Veranlagung und Krebs 1,2,3 bereitgestellt . Die Cancer Genome Atlas (TCGA) und internationalen Krebs Genom Konsortium (ICGC) haben die Identifizierung der genetischen Veränderungen, die in verschiedenen Arten von gemeinsamen Krebserkrankungen4verfolgt. Hunderte von wesentlicher Treiber Krebsgene erfolgreich identifiziert worden, und einige dieser Moleküle sind für Droge-Entwicklung1,5,6angestrebt.
In der klinischen Einstellung sind FFPE-Proben für die pathologische Diagnose und molekulare Tests für verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs gebräuchlich. Jedoch bei der Fixierung mit Formalin, tritt Vernetzung der DNA-Protein oder DNA-DNA und DNA-Fragmentierung wird induziert. Somit eignen sich FFPE DNA-Proben nicht immer zur genetischen Analyse wegen der geringen Qualität und Quantität der DNA-7,8,9. Darüber hinaus dauert es mehrere Tage FFPE-Proben vorbereiten und technisches Geschick ist notwendig, um die Abschnitte genau vorbereitet. Daher ist es wünschenswert, eine einfache und schnelle Methode zur Gewinnung qualitativ hochwertige intakte DNA zu entwickeln.
Zytologie ist eine alternative Methode für die pathologische Diagnose. Zytologische Probenvorbereitung ist eine einfachere, weniger teuer und schneller Ansatz im Vergleich zu FFPE Vorbereitung10. Die TIC-Technik wurde auf Sentinel-Lymphknoten und marginale Gewebe von Patientinnen mit Brustkrebs für intraoperative Schnelldiagnose für einige Jahre11,12durchgeführt. Allerdings gibt es einige Berichte, die untersucht, ob qualitativ hochwertige genomischer DNA aus TIC Proben extrahiert werden kann und für spätere genetische Analyse verwendet. Zytologische Präparate sind häufig mit Papanicolaou (Pap) oder Giemsa Färbung gefärbt, und wir haben bereits berichtet, dass die Menge und Qualität der von TIC Proben (vor allem Giemsa gefärbten Proben) extrahierte DNA Proben aus FFPE überlegen sind Gewebe-13. Verglichen mit PAP-Färbung, hat Giemsa Färbung einen Vorteil in weniger befleckenden Verfahren erfordern. Pap-Färbung, nach die Proben wurden behoben, und gebeizt, müssen sie montiert werden mit Montage Medium (z. B.Malinol) Probe Inhalt, z. B. Tumorzellen normalen Zellen und entzündlichen Zellen unter dem Mikroskop zu unterscheiden. Wenn die Pap-Probe ohne Montage Schritt bereit ist, ist es fast unmöglich, die Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten, weil die Probe getrocknet ist. Zum Vergleich: Giemsa Färbung im getrockneten Zustand beobachtet werden, daher die Montage-Schritt ist nicht erforderlich für schnelle zelluläre Bewertung. Für Mikrodissektion ist die Giemsa Färbung besser geeignet, da trockene Proben erforderlich.
In diesem Bericht wir stellen eine einfache und schnelle Methode für die Zubereitung von TIC Exemplare mit Giemsa Färbung und zeigen, dass TIC eine bessere Quelle für DNA verglichen mit FFPE-Proben.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir eine alternative Methode für den Erhalt der Tumor DNA aus klinischen pathologischen Proben mit TIC vorgestellt. TIC-Zubereitung ist sehr einfach und benötigt weniger Zeit im Vergleich zu FFPE Methoden, ohne die Forderung nach speziellen Instrumenten10. Alle Verfahren von der TIC-Vorbereitung zur DNA-Extraktion können innerhalb von zwei Tagen (Abbildung 1) abgeschlossen werden. Diese Methode verkürzt somit die Turnaround-Zeit für die Dur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen medizinischen und Dienstpersonal des Krankenhauses und die Patienten für die Zustimmung zur Teilnahme. Wir bedanken uns bei Gabrielle White Wolf, PhD, Edanz-Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für einen Entwurf des Berichts bearbeiten. Diese Studie wurde unterstützt durch eine Beihilfe für Genome Research Project aus der Präfektur Yamanashi (YH und M.O.) und einen Zuschuss von der YASUDA Medical Foundation (YH).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
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