タッチ捺印細胞診を用いた臨床病理標本から質の高い腫瘍 DNA を取得する簡易法
Summary
腫瘍組織から高品質 DNA を取得は、次世代シーケンシングによる遺伝子の変異を分析するための重要な第一歩です。この記事では腫瘍細胞を豊かにし、押印細胞診標本のタッチから無傷の DNA を取得する簡単かつ迅速な方法を提案する.
Abstract
管理およびがん患者のための特定の分子標的薬の治療前にがんの突然変異の状態を確認する重要です。臨床設定では、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織は、遺伝学的検査のため活躍しています。ただし、FFPE の DNA は、ホルマリン固定過程における断片化や破損は、一般的に。したがって、FFPE DNA は時々 低品質と量の DNA のための遺伝学的検査の適切ではないです。顕微鏡下で観察することができますタッチ捺印細胞診がん細胞からゲノム DNA を取得する (TIC) の方法をご紹介します。細胞形態と癌細胞数は、チックの標本を使用して評価できます。さらに、2 日以内 TIC サンプルからゲノム DNA の抽出を完了ことができます。合計金額、このメソッドを使用して得られた TIC DNA の品質 FFPE DNA のそれよりも高かった。この迅速かつ簡単な方法では、研究者 (例えば、次世代シーケンス解析、デジタル PCR および量的なリアルタイム PCR) 遺伝学的検査の高品質 DNA を取得し、結果をレポートのターンアラウンド時間を短縮することができます。
Introduction
次世代シーケンシング技術提供している研究者の遺伝の変化、メンデルの病気、遺伝的素因、がん1,2,3 のゲノム情報を解析の飛躍的な発展.がんゲノム アトラス (TCGA) と国際がんゲノム コンソーシアム (ICGC) は、一般的な癌4のいくつかの種類の遺伝子変異の同定を追求してきた。何百もの重要なドライバー遺伝子は正常に識別されているといくつかこれらの分子の薬物開発1,5,6のターゲットにされています。
臨床場面における FFPE 標本は病理診断とがんを含むさまざまな病気の分子テストのため通常使用されます。ただし、ホルマリンで固定過程では、DNA 蛋白質または DNA のクロスリンクが発生した、DNA 断片化を誘導しました。したがって、FFPE DNA サンプルは常に遺伝学的解析に適した DNA7,8,9の低質と量のため。また、FFPE 標本を準備するまでに数日かかるし、技術的なスキルのセクションを正確に準備する必要があります。したがって、高品質そのままな DNA を求める簡便かつ迅速な手法を開発することをお勧めします。
細胞診、病理組織学的診断のための代替方法です。細胞サンプル準備は簡単、以下の FFPE 準備10と比較して高価で、かつ高速なアプローチです。TIC 手法は、センチネル リンパ節と周辺組織のいくつかの年11,12術中迅速診断乳がん患者に行われています。ただし、チックの標本から高品質の DNA を得ることができるかどうかを検討して、その後の遺伝学的解析のため使用するほとんどの報告がありません。細胞診標本が一般的パパニコロー (Pap) またはギムザ染色、染色し、我々 は以前報告量と TIC 標本 (特にギムザ染色サンプル) から抽出した DNA の品質は FFPE から採取した試料よりも優れて組織13。Pap 染色に比べると、少ない汚損プロシージャを必要とする利点を有するギムザ染色.Pap 染色の後、サンプルを固定されているし、ステンド グラス、彼らマウントしますする必要がある媒体 (例えばMalinol)、腫瘍細胞、正常細胞、炎症細胞を顕微鏡など、サンプルの内容を区別するためのマウント。Pap の標本は、取付手順なし準備だない試料を乾燥するために顕微鏡下で細胞を観察することはほとんど不可能。比較では、乾燥した状態で観察することができますギムザ染色、したがって、取り付け手順は迅速に携帯電話評価する必要ありません。レーザーマイクロダイ セクション、ギムザ染色より適切な乾燥標本が必要なため。
本報告では TIC ギムザ染色標本を準備するための簡易迅速法を導入し、チックが dna の FFPE 標本と比較してより良いソースであることを示す.
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究ではチックを使用して臨床病理標本から腫瘍 DNA を取得するための代替方法を提案します。TIC 準備非常にシンプルかつ FFPE のメソッドは、特別な楽器10の要件なしと比較してより少ない時間を必要があります。(図 1) 2 日以内は、DNA の抽出に TIC 準備からすべての手順を完了できます。このメソッド従って遺伝学的検査を行うため所要時間が短く?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
参加に同意すること、病院と患者のすべての医療および補助的なスタッフに感謝しますガブリエル白狼、エダンズ ・ グループ (www.edanzediting.com/ac) このレポートの下書きを編集してから、博士に感謝いたします。本研究は、ゲノム研究プロジェクト (容湖とミズーリ州) は、山梨県からの助成金から、安田医療財団 (容湖) 補助金によって支えられました。
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
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