Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut
Summary
Nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée des marqueurs de cellules souches de la leucémie sur les cellules de la leucémie myéloïde aiguë primaire par cytométrie en flux. Nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes.
Abstract
La leucémie myéloïde aiguë (AML) est un hétérogène et si ne pas traitée, la maladie mortelle. C’est la cause la plus fréquente de mortalité associée à la leucémie chez l’adulte. Au départ, AML est une maladie des cellules souches hématopoïétiques (CSH) caractérisée par l’arrestation de différenciation, accumulation subséquente de cellules blastiques de leucémie et réduit la production d’éléments hématopoïétiques fonctionnelles. L’hétérogénéité s’étend à la présence de cellules souches de la leucémie (LSC), avec cette cellule dynamique compartiment évoluer pour surmonter les diverses pressions de sélection imposée pendant le traitement et l’évolution de la leucémie. Pour définir plus précisément la population de la LSC, l’ajout de CD90 et CD45RA permet la discrimination de la GPX normales et de cellules souches multipotentes dans le compartiment de cellules CD34 + CD38. Ici, nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée de plusieurs marqueurs LSC putatifs (CD34, CD38, CD45RA CD90) sur primaire les cellules blastiques AML humaine par cytométrie en flux multiparamétrique. De plus, nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes. Cette méthode de détection et de quantification de LSC putatif sont utilisables pour suivi clinique de la réponse de la chimiothérapie (i.e., maladie résiduelle), comme le LSC résiduelle peut provoquer une récidive AML.
Introduction
Leucémie myéloïde aiguë (LMA) est la cause la plus fréquente de mortalité associée à la leucémie. Initialement, AML est une maladie clonale de cellules souches hématopoïétiques (CSH) caractérisée par l’arrestation de différenciation, accumulation subséquente de cellules blastiques et réduit la production d’éléments hématopoïétiques fonctionnelles. Récemment, clonale hétérogénéité de la population cellulaire blast a été établie essentiellement à l’aide de stratégies de séquençage (NGS) prochaines génération et montrant l’existence d’une évolution intra-clonale de cellules de tumeur1.
L’hétérogénéité s’étend à la présence de cellules souches leucémiques (LSC). Il est possible que ce compartiment cellulaire dynamique évolue pour surmonter les diverses pressions de sélection imposées pendant le traitement et l’évolution de la leucémie. C’est pourquoi LSC sont censés être résistante aux traitements chimiothérapeutiques actuels et agir comme médiateur de la rechute de la maladie, avec de profondes implications cliniques2. Différents marqueurs ont été décrites pour caractériser la LSC comme CD1233, CLL-14, CD975 ou TIM-3,6. Le CD34 + CD38-compartiment de cellules blastiques est censé être enrichie pour LSC7 mais inclut également des HSC normal. CD90 et CD45RA expression appliquée à la CD34 + CD38-compartiment (P6) (Figure 1) permet de séparer plusieurs étapes de précurseurs hématopoïétiques normales et malignes8. Plus précisément, normaux CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-CSH, multipotentes progéniteurs (MPP) comme CD90dimCD45RA-cellules CD34 + CD38 et CD34 + CD38-CD90-CD45RA + cellules souches multipotentes lymphoïdes-amorcé (PPSP) peuvent être déterminées dans la plupart des AML cas8 ,,9. L’intensité de la fluorescence moyenne (IFM) de CD38 est particulièrement importante à considérer dans le compartiment de cellules CD34 +. Parce que l’intensité CD38 définit trois nouveaux compartiments cellulaires celle-ci : CD38 négatif (P6), CD38 dim (P7) et CD38 lumineux (P8) (Figure 1). L’IFM de CD38 peut être déterminée à l’aide de hematogones ou plasmocytes comme contrôle positif interne que ces cellules expriment fortement CD38.
Le modèle de sourisnull (NSG) immunodéficientes NOD/SCID/IL2Rγc est employé couramment pour greffe de normal et les cellules hématopoïétiques malignes humaines10,11. Série de xénotransplantation dosages sont utilisés pour valider expérimentalement fonction LSC ou HSC. Ces études ont été longuement analysés par les approches de séquençage à grande échelle. Néanmoins, on connaît moins le LSC et HSC lymphoblastiques de population de blast AML implantée chez des souris NSG par rapport à ses principaux AML (Figure 2).
Les numéros de LSC sont donc intrinsèquement faibles, identification et quantification de LSC sont difficiles et la méthode décrite ici peut être épuisée comme un essai de cytométrie en flux au diagnostic et au suivi clinique pour évaluer la réponse de la chimiothérapie (comme résiduel LSC peut provoquer une récidive AML). La présence de LSC peut indiquer la maladie résiduelle positive (MRD). À ce jour, MRD surveillance principalement dans AML s’appuient sur des méthodes moléculaires (c.-à-d., RT-PCR, NGS)10,12. Toutefois, dans ce protocole nous détectons expression de la protéine simultanée de plusieurs marqueurs HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA CD90) sur primaire les cellules blastiques AML humaine par multiparamétriques écoulement cytometry2,8,9. Cette combinaison d’anticorps peut être appliquée dans n’importe quel laboratoire de cytométrie de flux standard et ce dosage MRD de débit est particulièrement intéressant lorsque MRD par PCR en temps réel (RT-PCR) n’est pas possible, c’est-à-diresi spécifique de la leucémie moléculaire marqueurs ne sont pas détectables dans l’échantillon diagnostic d’AML. En outre, le présent protocole, est complémentaire aux techniques plus sensibles MRD moléculaires, puisqu’il vise à détecter et à quantifier les cellules progénitrices hématopoïétiques anormales qui représente une caractéristique fonctionnelle cellulaire (Figure 3).
Nous montrons comment quantifier les trois populations de cellules souches hématopoïétiques et du compartiment de LSC putatif avec le degré de maturation par cytométrie de flux avec des anticorps disponibles dans la plupart des laboratoires cliniques. En outre, nous a confirmé la présence de ces compartiments cellulaires en correspondants patient-dérivés-xénogreffes (PDX) et au traitement suivi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une évaluation précise et reproductible de membrane ou de marqueurs cytoplasmiques par cytométrie nécessite que les paramètres de l’instrument sont vérifiés tous les jours pour un alignement optique, bon fonctionnement du systeme fluidique, sensibilité optique et normalisation à l’aide de perles de calibration.
Détection des populations cellulaires blast AML utilisant CD90 et CD45RA par analyse en cytométrie en flux multi paramétrique est une méthode relativement simple et fia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par le Français Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Centre Nord), Fondation de France (Comité de leucémie), SIRIC Oncolille et Français du National Cancer Institute.
Materials
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
