Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen
Summary
Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.
Abstract
Akuter myeloischer Leukämie (AML) ist eine heterogene, und wenn Sie nicht behandelt, tödliche Krankheit. Es ist die häufigste Ursache der Leukämie-assoziierten Sterblichkeit bei Erwachsenen. AML ist zunächst eine Erkrankung des blutbildenden Stammzellen (HSC) zeichnet sich durch die Verhaftung der Differenzierung, nachfolgende Ansammlung der Leukämiezellen Blast, und reduziert die Produktion von hämatopoetischen Funktionselemente. Heterogenität erstreckt sich auf das Vorhandensein von Leukämie-Stammzellen (LSC), mit dieser dynamischen Zelle Fach weiterentwickelt wird, um verschiedene Auswahl-Druck zu überwinden während Leukämie Progression und Behandlung auferlegt. Um die LSC-Bevölkerung weiter zu definieren, ermöglicht das Hinzufügen von CD90 und CD45RA die Diskriminierung von normalen HSCs und multipotenten Vorläuferzellen innerhalb der CD34 + CD38 Zellkompartiment. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck mehrere vermeintliche LSC-Marker (CD34, CD38, CD45RA, CD90) zu erkennen am primären Blastenzellen des menschlichen AML durch multiparametric Durchflusszytometrie. Darüber hinaus zeigen wir, wie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate. Diese Methode zur Erkennung und Quantifizierung von vermeintlichen LSC für die klinische Weiterbehandlung der Chemotherapie Antwort verwendet werden (zB., minimaler Resterkrankung), als passives LSC AML Rückfall verursachen.
Introduction
Akuter myeloischer Leukämie (AML) ist die häufigste Ursache der Leukämie-assoziierten Sterblichkeit. AML ist zunächst eine klonale Erkrankung der blutbildenden Stammzellen (HSC) zeichnet sich durch die Verhaftung der Differenzierung, nachfolgende Anhäufung von Blasten, und reduziert die Produktion von hämatopoetischen Funktionselemente. Vor kurzem wurde klonale Heterogenität der Explosion Zellpopulation im Wesentlichen durch die Verwendung der nächsten Generation Sequencing (NGS) Strategien und zeigen die Existenz der Intra klonale Evolution von Tumor-Zellen1gegründet.
Heterogenität erstreckt sich auf das Vorhandensein von leukämischen Stammzellen (LSC). Es wird vermutet, die diese dynamische Zellkompartiment entwickelt, um verschiedene Auswahl Druck auferlegt bei Leukämie Progression und Behandlung zu überwinden. Daher LSC sollen resistent gegenüber aktuellen chemotherapeutischen Therapien und Krankheit Rückfall mit profunden klinischen Implikationen2zu vermitteln. Verschiedene Marker wurden zur Charakterisierung von LSC wie CD1233, CLL-14, CD975 oder TIM-36beschrieben. CD34 + CD38-Abteil des Blastenzellen gilt für LSC7 angereichert werden aber auch normale HSC. CD90 und CD45RA Ausdruck angewendet, die CD34 + CD38-Fach (P6) (Abbildung 1) ermöglicht es, um mehrere Stufen von normalen und malignen hämatopoetischen Vorläufer8zu trennen. Speziell, normale CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent Vorfahre (MPP) wie CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-Zellen und CD34 + CD38-CD90-CD45RA + lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP) Zellen, in der Mehrzahl der AML ermittelt werden Fälle8 ,9. Der mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von CD38 ist besonders wichtig, innerhalb der CD34 + Zellkompartiment berücksichtigt werden. Da CD38 Intensität drei neue Zelle Fächer davon definiert: CD38 negativ (P6), CD38 Dim (P7) und CD38 hell (P8) (Abbildung 1). Die MFI CD38 kann entweder Hematogones und/oder Plasmazellen als interne positive Kontrolle mit, wie diese Zellen stark CD38 ausdrücken bestimmt werden.
Die immungeschwächte NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) Maus-Modell ist weit verbreitet für Engraftment des normalen und bösartigen Menschen hämatopoetischen Zellen10,11. Serielle Xenotransplantation Assays werden verwendet, um experimentell LSC oder HSC-Funktion überprüfen. Diese Studien wurden weitgehend durch groß angelegte Sequenzierung Ansätze analysiert. Dennoch ist weniger über die LSC und HSC Immunophenotype AML Explosion Bevölkerung pfropfte in NSG-Mäuse im Vergleich zu seiner primären AML (Abbildung 2) bekannt.
Die Zahl der LSC sind somit von Natur aus niedrigen, Identifizierung und Quantifizierung der LSC sind anspruchsvoll und die hier beschriebene Methode verwendet werden als ein Fluss durchflusszytometrischen Assay zum Zeitpunkt der Diagnose und bei klinischen Folgen bis Chemotherapie Antwort bewerten (wie passives LSC kann verursachen Sie AML Rückfall). Das Vorhandensein von LSC möglicherweise positiven minimalen Resterkrankung (MRD). Bis dato MRD Überwachung in AML meist verlassen Sie sich auf molekulare Methoden (d.h., RT-PCR, NGS)10,12. Jedoch in diesem Protokoll erkennen wir gleichzeitige Protein-Expression von mehreren HSC/LSC-Markern (CD34, CD38, CD45RA, CD90) auf primäre Blastenzellen des menschlichen AML durch multiparametric Flow Cytometry2,8,9. Diese Kombination von Antikörpern kann in jedem standard Flow Cytometry Labor angewendet werden und dieser Fluss-MRD-Assay ist besonders interessant, wenn MRD durch Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) nicht möglich ist, d. h., wenn Leukämie spezifische molekulare Marker sind nicht in die Diagnose AML Probe nachweisbar. Darüber hinaus ist dieses Protokolls komplementär zu empfindlicheren molekularen MRD-Verfahren, da es darum geht zu erkennen und zu quantifizieren, die abnorme hämatopoetischen Vorläuferzellen die repräsentiert einer funktionelle Zelle-Eigenschaft (Abbildung 3).
Wir zeigen, wie Sie drei hämatopoetischen Vorläuferzellen Populationen und die vermeintliche LSC-Fach mit unterschiedlichen Grad der Reifung durch Durchflusszytometrie mit Antikörpern zur Verfügung, in der Mehrzahl der klinischen Labors zu quantifizieren. Darüber hinaus wir bestätigte das Vorhandensein dieser Zelle Abteilungen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate (PDX) und bei der Behandlung verfolgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine genaue und reproduzierbare Beurteilung der Membran oder zytoplasmatischen Marker durch Durchflusszytometrie erfordert, dass Geräteeinstellungen für optische Ausrichtung, das ordnungsgemäße Funktionieren der fluidische System, optische Empfindlichkeit und Standardisierung täglich überprüft werden unter Verwendung der Kalibrierung Korne.
Nachweis von Blast Zell-Populationen in AML mit CD90 und CD45RA durch multiparametrischen Flow-Zytometrie-Analyse ist eine relativ einfache und zuve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Französisch Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (North Center), Fondation de France (Leukämie Committee), SIRIC Oncolille und französische National Cancer Institute unterstützt.
Materials
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
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