Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하
Summary
우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.
Abstract
급성 골수성 백혈병 (AML)은 다른 유형의 그리고 치료 하지 않으면, 치명적인 질병. 그것은 성인 백혈병 관련 된 사망의 가장 흔한 원인입니다. 처음, AML는 조 혈 줄기 세포 (HSC)의 질병 차별화, 폭발 세포 백혈병의 후속 축적의 체포를 특징으로하 고 기능성 조 혈 요소의 생산을 감소. 이 백혈병 줄기 세포 (LSC)의 존재를 확장,이 동적 셀 다양 한 선택 압력을 극복 하기 위해 진화 하는 구획 부과 시 백혈병 진행 및 치료 하는 동안. LSC 인구를 추가로 정의 하려면 CD90 추가 CD45RA CD34 + CD38-셀 구획 내에서 정상적인 HSCs multipotent 창시자의 차별 수 있습니다. 여기, 우리 multiparametric cytometry에 의해 인간의 AML의 기본 폭발 셀에 여러 개의 상 상속 LSC 마커 (CD34, CD38, CD45RA, CD90)의 동시 표현 검색 프로토콜 개요. 또한, 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다. 검색의이 방법 및 상 상속 LSC의 정량화 임상 후속의 화학 요법 응답 사용할 수 있습니다 (즉., 최소 잔여 질병), 잔여 LSC AML 재발을 일으킬 수 있습니다.
Introduction
급성 골수성 백혈병 (AML) 백혈병 관련 된 사망의 가장 흔한 원인입니다. 처음, AML는 조 혈 줄기 세포 (HSC)의 클론 질병 차별화, 폭발 셀의 후속 축적의 체포를 특징으로하 고 기능성 조 혈 요소의 생산을 감소. 최근, 폭발 세포 인구의 클론이 차세대 시퀀싱 (NGS) 전략을 사용 하 여 종양 세포1의 내부 클론 진화의 존재를 보여주는 본질적으로 설립 되었습니다.
이 leukemic 줄기 세포 (LSC)의 존재를 확장합니다. 그것은이 동적 셀 구획 백혈병 진행 및 치료 하는 동안에 부과 하는 다양 한 선택 압력을 극복 하기 위해 진화 가설입니다. 따라서 LSC 현재 화학요법 식이요법을 저항 하 고 깊은 임상 의미2질병 재발을 중재 하는데 있다. 다양 한 마커 CD1233, CLL-14, CD975 또는6팀-3 같은 LSC 하 설명 했습니다. CD34 + CD38-폭발 세포의 구획 LSC7 농축 간주 됩니다 하지만 또한 정상적인 HSC를 포함 합니다. CD90 CD45RA 표현 CD34 + CD38에 적용-정상 및 악성 조 혈 전8의 몇몇 단계를 분리 하는 허가 (P6) 구획 (그림 1). 특히, 정상적인 CD34 + CD38, CD90 + CD45RA HSCs, multipotent 창시자 (MPP) 같은 CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-세포와 CD34 + CD38-CD90-CD45RA + 림프 액 multipotent 조상 (LMPP) 셀 AML의 대부분에 결정 될 수 있는 경우8 ,9. CD38의 평균 형광 강도 (MFI) CD34 + 세포 구획 내에서 고려 되어야 하는 특히 중요 하다. CD38 강도 3 개의 새로운 세포 구획 그를 정의 하기 때문에: CD38 네거티브 (P6), CD38 dim (P7)와 CD38 밝은 (P8) (그림 1). CD38 MFI를 사용 하 여 hematogones 또는 플라즈마 세포 내부 긍정적인 컨트롤로 이러한 세포는 강하게 CD38 표현으로 결정 될 수 있습니다.
Immunodeficient 끄 덕/SCID/IL2Rγcnull (NSG) 마우스 모델은 정상의 engraftment를 위해 널리 이용 된다 그리고 악성 인간 조 혈 모 세포10,11. 직렬 xenotransplantation 분석 LSC 또는 HSC 함수를 실험적으로 확인 하는 데 사용 됩니다. 이 연구는 광범위 하 게 대규모 시퀀싱 접근에 의해 분석 되었습니다 했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 덜 AML 폭발 인구는 주요 AML (그림 2)에 비해 NSG 쥐에 engrafted LSC 및 HSC immunophenotype에 대 한 알려져 있다.
LSC의 숫자는 이렇게 본질적으로 낮은, 식별 및 LSC의 정량화는 도전 하며 여기에 설명 된 방법을 사용할 수 있습니다 흐름 cytometric 분석 결과 진단 및 임상 수행으로 (로 잔여 LSC 수 있습니다 화학 요법 응답을 평가 하 급성 골수성 백혈병 재발 발생할). LSC의 존재는 긍정적인 최소 잔여 질병 (MRD)를 나타낼 수 있습니다. 날짜 하려면, MRD 분자 방법 (즉, RT-PCR, NGS)에 의존 대부분 AML에 모니터링10,12. 그러나,이 프로토콜에 우리 검색 여러 HSC/LSC 마커 (CD34, CD38, CD45RA, CD90)의 동시 단백질 표정 인간의 AML의 기본 폭발 셀에 multiparametric 흐름 cytometry2,,89. 항 체의이 조합은 어떤 표준 흐름 cytometry 실험실에 적용 될 수 있습니다 그리고이 흐름 MRD 분석 결과 특히 재미 있는 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 MRD 불가능 때 즉, 경우 백혈병 특정 분자 마커 진단 AML 샘플에서 감지 되지 않습니다. 또한,이 프로토콜은 더 민감한 분자 MRD 기술 보완으로 감지 하 고 비정상적인 조 혈 조상 세포를 계량 하는 것을 목표로 나타내는 기능 셀 특성 (그림 3).
우리 3 조 혈 모 조상 인구와 성숙의 다른 학위를 가진 상 상속 LSC 구획 cytometry 임상 실험실의 대부분에서 사용할 수 있는 항 체와 함께 하 여 계량 하는 방법을 보여 줍니다. 또한, 우리는 해당 환자-파생-xenografts (PDX) 이러한 셀 구획의 존재를 확인 하 고 치료에 후속.
Protocol
Representative Results
Discussion
막 또는 세포질 마커 cytometry에 의해 정확 하 고 재현성 평가 악기 설정을 매일 광학 정렬, 적절 한 유체 시스템, 광학 감도 및 표준화의 기능에 대 한 확인 필요 교정 구슬을 사용 하 여.
AML CD90 및 CD45RA를 사용 하 여 다중 변수 흐름 cytometry 분석에서 폭발 세포 인구의 탐지는 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 분석에서 중요 한 단계는 CD34 + CD38-인구의 정확한 게?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일부 프랑스 협회 Laurette Fugain, LigueContre 르 암 (북한 센터), Fondation 드 프랑스 (백혈병 위원회), SIRIC Oncolille, 및 프랑스 국립 암 연구소에서 지원 됩니다.
Materials
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
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