以层流为基础的检测培养血管细胞和粘附血小板白细胞的研究
Summary
在血管壁损伤或炎症期间, 白细胞与血管细胞和血小板相互作用。在这里, 我们描述了一种简单的基于层流的检测方法来表征白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。
Abstract
近几十年来, 在伤害或组织损伤部位对白细胞的招募进行了调查, 并导致了白细胞黏附性级联的概念。然而, 尚未充分确定参与白细胞招募的确切分子机制。由于白细胞的招募仍然是感染, 炎症, 和 (自动) 免疫研究领域的一个重要课题, 我们提出了一个简单的层流基础的分析研究的基础机制的黏附力, 脱粘, 并在静脉和动脉血流机制下的白细胞轮回。体外分析可用于研究在不同的血管炎症模型中, 白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。该协议描述了一种基于层流的检测方法, 使用平行流腔和倒置相衬显微镜连接到一个相机, 研究白细胞和内皮细胞或血小板的相互作用, 然后再进行可视化和记录。离线分析。内皮细胞、血小板或白细胞可以用抑制剂或抗体进行预处理, 以确定特定分子在这个过程中的作用。剪切条件,即动脉或静脉剪切应力, 可以很容易地适应的粘度和流速的灌注液和高度的渠道。
Introduction
在受伤, 炎症, 或感染, 白细胞迅速反应病原体-或损害相关的分子模式 (PAMPs, 抑), 转变成一个活化状态, 并从血液流到炎症和组织损伤部位。白细胞与细胞和分子环境相互作用的能力, 对于它们作为免疫细胞的正确功能是必不可少的, 如白细胞黏附缺陷1所突出的基因紊乱。白细胞黏附一直是在过去几十年的激烈调查的主题, 这导致了白细胞粘附级联在二十世纪九十年代代初2,3的概念。白细胞黏附是由选择素介导的白细胞捕获到内皮细胞引发的, 从而导致了血管表面的滚动。这种滚动使白细胞扫描血管内皮细胞的迁移线索,例如, 趋化因子, 诱导激活的整合。随后, 活化整合介导与内皮配体的结合, 导致坚固白细胞的拘捕。白细胞随后会通过爬行和传播来准备 extravasate, 然后穿透内皮细胞单层和 transmigrating 进入底层组织。标准白细胞级联的基本概念自引入以来基本上保持不变, 有些中间步骤添加了4。然而, 目前还没有阐明参与白细胞招募的许多参与者的确切分子机制和作用, 而白细胞的招募仍然是感染、炎症和 (自动) 免疫领域的一个重要课题。研究。
例如, 在血管炎症性疾病, 如动脉粥样硬化, 增加白细胞招募到血管壁驱动斑块发展。不稳定的动脉粥样硬化斑块可能会破裂, 导致血小板和凝血系统的大规模活化, 随后阻断血管5。这可能导致严重的心血管后果, 如心肌梗死或中风。此外, 在临床上发生内皮剥脱,例如冠状动脉支架术后, 导致大量的白细胞和血小板相互作用于暴露的血管壁内部 (例如, 基质成分和平滑肌细胞) 和与血小板覆盖血管损伤的白细胞。这些相互作用是重要的进一步发展的疾病, 因为单核细胞-血小板相互作用可能驱动新生内膜形成6, 7.此外, 白细胞整合素 Mac-1 (αMβ2) 和血小板 GPIbα介导的血小板-白细胞相互作用最近被确定为小鼠8中血栓形成的新驱动因素。
鉴于人类和动物血液作为研究的白细胞和血小板来源的广泛存在, 以及分离基质分子和白细胞和血管起源的永生化细胞系的广泛存在, 模拟白细胞是可行的。在实验室环境中, 使用特别设计的流灌注室进行相互作用。在过去的几十年中, 许多变种已经被设计出来, 从真空驱动到自粘式灌注室不等。所有变体都有共同之处, 即不动部分 (例如, 培养的血管细胞或基质蛋白) 被组装成一个更大的防漏室, 装有预先定义的通道, 使液体在静止的部分上灌注。此外, 成型技术的进步使得基于硅树脂的定制解决方案的开发成为了9。流化液的粘度和流速以及通道的高度, 主要决定了流量灌注装置的剪切应力特性10。在本文中, 我们提出了一个体外方法来研究在静脉和动脉流机制下白细胞黏附、脱粘和轮回的机制。这里提出的方法的优点是, 它们可以使用普通的摄像机连接荧光显微镜进行, 并且不需要实验者拥有高的技术熟练程度。体外分析可以通过多种方式进行操作 (例如, 添加抑制剂或阻断抗体), 因而适用于不同的血管炎症模型, 并允许对黏附蛋白功能的研究或对特定化合物的评价。
Protocol
Representative Results
Discussion
此体外检测是一种直接的方法, 用于研究血管炎症过程中白细胞招募的基本机制, 但还有一些关键的问题需要注意。成功执行这项检测的第一项要求是在完整的、汇合的血管或血小板单层上灌注白细胞。这可以通过预先涂覆胶原 i 型的表面来实现。一般来说, 在使用主血管细胞的时候, 用推荐的含胶原酶的分离溶液轻轻地拆下细胞是很重要的 (请参阅材料表), 这种方法不那么严格,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Drs, 马丁. 施密特和线 Fraemohs。这项工作得到荷兰科学研究基金会 (ZonMW 大帝 016.126.358, 兰德斯塔纳输血研究基金会 (LSBR Nr 1638) 和德意志 Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) 的支持, 获得 R.R.K。
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
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