Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen
Summary
Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.
Abstract
Die Rekrutierung von Leukozyten nach Verletzung oder Entzündung zu Websites von Verletzungen oder Gewebeschäden wurde in den letzten Jahrzehnten untersucht und führte das Konzept der Leukozyten Adhäsion Kaskade. Die genauen molekularen Mechanismen bei der Rekrutierung von Leukozyten haben jedoch noch nicht vollständig geklärt. Da Leukozyten Rekrutierung ein wichtiges Thema im Bereich der Infektion, Entzündung und (Auto-) immun Forschung bleibt, präsentieren wir einen einfachen Laminar-Flow-based Assay zu studieren zugrunde liegenden Mechanismen der Adhäsion, de-Haftung und Transmigration von Leukozyten unter venösen und arteriellen Strömungsformen. Der in-vitro- Test kann verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu studieren, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner in verschiedenen Modellen von vaskulären Entzündung zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt eine Laminar-Flow-based Assays mit Parallel Strömungsraum und einem inversen Phase-Kontrast-Mikroskop mit einer Kamera verbunden, untersuchen die Wechselwirkungen der Leukozyten und Endothelzellen oder Thrombozyten, die visualisiert und dann aufgezeichnet werden können offline analysiert. Endothelzellen, Thrombozyten und Leukozyten können mit Inhibitoren oder Antikörper gegen die Rolle bestimmter Moleküle während dieses Prozesses bestimmen vorbehandelt werden. Scher Bedingungen, d.h. arterielle oder venöse Schubspannung, können leicht durch die Viskosität und die Durchflussmenge der PERFUNDIERTEN Flüssigkeiten und die Höhe des Kanals angepasst werden.
Introduction
Bei Verletzungen, Entzündungen oder Infektionen reagieren Leukozyten schnell auf Erreger – oder Schaden-assoziierte molekulare Muster (PAMPs, DAMPs), in einem aktivierten Zustand ändern und bewegen aus der Blutbahn zu Stätten der Entzündungen und Gewebeschäden. Die Fähigkeit der Leukozyten zur Interaktion mit ihrer zellulären und molekularen Umgebung unbedingt für ihr korrektes funktionieren wie Immunzellen, wie durch genetische Störungen wie Leukozyten Adhäsion Mangel1hervorgehoben. Leukozyten Adhäsion ist Gegenstand intensiver Untersuchung während der vergangenen Jahrzehnte und dies führte das Konzept der Leukozyten Adhäsion Kaskade in den frühen 1990er Jahren2,3. Leukozyten Adhäsion wird durch die selektin-vermittelte Aufnahme von Leukozyten des Endothels verursacht die Zellen die Fortschreibung der vaskulären Oberfläche initiiert. Diese Rollen kann Leukozyten Scannen für Endothel-gebundenen wandernden Hinweise, z. B., Chemokine, die die Aktivierung der Integrine zu induzieren. Anschließend vermitteln die aktivierten Integrine die Bindung an Endothelzellen Liganden, wodurch feste Leukozyten Verhaftung. Leukozyten können anschließend bereiten Sie Leber durch kriechen und verbreiten, vor dem Eindringen in die Endothelzellen Monolage und einen in das darunter liegende Gewebe. Das Grundkonzept der kanonischen Leukozyten Kaskade hat seit seiner Einführung weitgehend unverändert, mit einigen Zwischenschritten hinzugefügt4. Dennoch, die genauen molekularen Mechanismen und die Rollen der viele Akteure in der Rekrutierung von Leukozyten nicht geklärt so weit und Leukozyten Einstellung bleibt ein wichtiges Thema im Bereich der Infektion, Entzündung und (Auto-) immun Forschung.
Beispielsweise erhöht während der entzündlichen Gefäßerkrankungen wie Arteriosklerose, Leukozyten Rekrutierung in die Behälter Wand Laufwerke Plaque Entwicklung. Instabile arteriosklerotische Plaques könnte platzen, zu einer massiven Aktivierung von Blutplättchen und das Gerinnungssystem und anschließend zur Okklusion des Schiffes5führt. Dies kann zu schweren Herz-Kreislauf-Ergebnisse wie Herzinfarkt oder Schlaganfall führen. Endotheliale Denudation als es tritt klinisch, z.B. nach Stentimplantation einer Koronararterie führt zusätzlich zu einer Vielzahl von Interaktionen von Leukozyten und Thrombozyten, die exponierten Schiff wandinnenseite (z.B.Matrix Komponenten und glatt Muskel-Zellen) und der Leukozyten mit Thrombozyten deckt der gefäßverletzung. Diese Interaktionen sind wichtig für die weitere Entwicklung der Krankheit wie Monocyte-Thrombozyten Interaktionen Neointima Bildung6,7fahren könnte. Darüber hinaus Thrombozyten-Leukozyten Interaktion vermittelt durch Leukozyten Integrin Mac-1 (αMβ2) und Thrombozyten GPIbα vor kurzem als neue Treiber von Thrombosen in Mäusen8eingestuft wurden.
Angesichts die breite Verfügbarkeit von Mensch und Tier Blut als eine Quelle von Leukozyten und Thrombozyten für Forschung und das breite Spektrum der isolierten Matrix Moleküle und immortalisierte Zelllinien von Leukozyten und vaskulären Ursprungs ist es machbar, Leukozyten zu simulieren Interaktionen unter fließen in ein Labor einrichten, mit speziell entwickelten Fluss Perfusion Kammern. Viele Varianten wurden in den vergangenen Jahrzehnten, von Vakuum-getrieben bis hin zu selbstklebenden Perfusion Kammern entwickelt. Alle Varianten haben gemein, die der unbewegliche Teil (z.B., kultivierten vaskuläre Zellen oder matrixproteine) in eine größere auslaufsichere Kammer ausgestattet mit einem vorab definierten Kanal ermöglicht Perfusion von Flüssigkeiten über den unbeweglichen Teil montiert ist. Darüber hinaus ermöglichte Fortschritte in molding Technologie die Entwicklung von maßgeschneiderten Lösungen auf Basis von Kieselsäure Polymere9. Die Viskosität und die Durchflussmenge der PERFUNDIERTEN Flüssigkeiten und die Höhe des Kanals bestimmen vor allem die Scherspannung Eigenschaften der Strömung Perfusion Gerät10. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine in-vitro- Methode zu studieren zugrunde liegenden Mechanismen der Adhäsion, de-Adhäsion und Transmigration von Leukozyten unter venösen und arteriellen Strömungsformen. Der Vorteil der hier vorgestellten Methoden ist, dass sie mit einem gemeinsamen Kamera angeschlossen Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden können, und erfordern keine Experimentatoren, hohe technische Qualifikation besitzen. Der in-vitro- Test kann in vielerlei Hinsicht (z. B.durch Hinzufügen von Inhibitoren oder blockieren Antikörper), manipuliert werden und gilt somit in verschiedenen Modellen von vaskulären Entzündung und ermöglicht die Untersuchung der Adhäsion Proteinfunktionen oder die Bewertung der spezifischen Verbindungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser in-vitro- Test ist eine einfache Methode, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten während einer vaskulären Entzündung untersuchen, aber es gibt einige kritische Punkte zu beachten. Die erste Voraussetzung für die Durchführung von dieser Test erfolgreich ist die Perfusion der Leukozyten über ein intaktes und konfluierende Gefäß- oder Thrombozyten monomolekularen Film. Dies kann erreicht werden durch die vorherige Beschichtung der Oberflächen mit Kollagen Typ ich. Im A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Martin M. Schmitt und Linie Fraemohs. Diese Arbeit wurde von der niederländischen Stiftung für wissenschaftliche Forschung (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR Nr. 1638) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) an R.R.K. vergeben unterstützt.
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
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