Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes
Summary
Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.
Abstract
O recrutamento de leucócitos após lesão ou inflamação a locais de lesão ou dano tecidual foi investigado durante décadas recentes e resultou no conceito de cascata de adesão de leucócitos. No entanto, os mecanismos moleculares exatos envolvidos no recrutamento de leucócitos ainda não foram totalmente identificados. Desde o recrutamento de leucócitos continua a ser um tema importante no campo da infecção, inflamação e (auto) imune pesquisa, apresentamos um ensaio simples baseada em fluxo laminar para estudar os mecanismos subjacentes da adesão, de adesão, e transmigração de leucócitos sob regimes de fluxo arterial e venoso. O ensaio em vitro pode ser usado para estudar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre leucócitos e seus parceiros celulares em diferentes modelos de inflamação vascular. Este protocolo descreve um ensaio baseado em fluxo laminar, utilizando uma câmara de fluxo paralelo e um microscópio de contraste de fase invertido conectado a uma câmera para estudar as interações de leucócitos e células endoteliais ou plaquetas, que podem ser visualizadas e gravadas em seguida análise off-line. Células endoteliais, plaquetas ou leucócitos podem ser pré-tratados com inibidores ou anticorpos para determinar o papel de moléculas específicas durante este processo. Condições de cisalhamento, ou seja, arterial ou venosa tensão de cisalhamento, podem ser facilmente adaptadas pela viscosidade e vazão dos fluidos perfundidos e a altura do canal.
Introduction
Após lesão, inflamação ou infecção, leucócitos respondem rapidamente ao patógeno ou dano-associada molecular padrões (PAMPs, represas), mudar para um estado ativado e mover fora do fluxo de sangue para locais de inflamação e tecido danos. A capacidade dos leucócitos de interagir com seu ambiente celular e molecular é essencial para a sua correta função como células do sistema imunológico, como destacado por desordens genéticas, como a adesão de leucócitos deficiência1. Adesão de leucócitos tem sido objecto de intensa investigação durante as últimas décadas, e isto resultou no conceito de cascata de adesão de leucócitos no início da década de 1990,2,3. Adesão de leucócitos é iniciada pela captura selectina-mediada dos leucócitos ao endotélio, fazendo com que as células a rolar sobre a superfície vascular. Este rolamento permite leucócitos procurar pistas migratórias endotélio-limite, por exemplo, quimiocinas, que induzem a ativação das integrinas. Posteriormente, as integrinas activadas mediam a ligação a ligantes endoteliais, resultando na prisão de leucócitos firme. Leucócitos podem posteriormente Prepare-se para extravasate rastejando e espalhando-se, antes de penetrar a monocamada endotelial e reencarnando no tecido subjacente. O conceito básico da cascata canônico leucócito tem permaneceram praticamente inalteradas desde a sua introdução, com algumas etapas intermediárias adicionado4. No entanto, os mecanismos moleculares exatos e os papéis de muitos jogadores envolvidos no recrutamento de leucócitos não foram clarificados, até agora, e recrutamento de leucócitos continua a ser um tema importante no campo da infecção, inflamação e (auto-) imune pesquisa.
Por exemplo, durante doenças inflamatórias vasculares como aterosclerose, aumentou o recrutamento de leucócitos para o vaso parede drives placa desenvolvimento. Ateroma instável pode se romper, levando à enorme ativação de plaquetas e o sistema de coagulação e posteriormente à oclusão do vaso5. Isso pode resultar em graves resultados cardiovasculares como infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral. Além disso, por exemplo, após implante de stent de uma artéria coronária, desnudamento endotelial que ocorre clinicamente, conduz a uma infinidade de interações de leucócitos e plaquetas para o interior de parede vaso expostas (por exemplo, componentes de matriz e liso as células do músculo) e de leucócitos com plaquetas cobrindo a lesão vascular. Essas interações são importantes para o desenvolvimento da doença como interações monócito plaquetas podem conduzir neointima formação6,7. Além disso, as interações leucócito-plaquetas mediada por leucócitos integrina Mac-1 (M. α β2) e plaquetas GPIbα recentemente foram identificados como drivers de romance de trombose em ratos8.
Dada a ampla disponibilidade de sangue humano e animal como fonte de leucócitos e plaquetas para pesquisa e o amplo espectro de moléculas isoladas de matriz e linhas de célula imortalizado de origem vascular e leucócitos, é possível simular leucócitos interações sob fluxo em um laboratório de configuração, usando câmaras de perfusão de fluxo especialmente concebidos. Muitas variantes foram projetadas nas últimas décadas, variando de orientado a vácuo para câmaras de perfusão autoadesivo. Todas as variantes têm em comum que a parte imóvel (por exemplo, culturas de células vasculares ou proteínas da matriz) é montada em uma câmara de estanques maior equipada com um canal predefinido permitindo a perfusão dos fluidos sobre a parte do imóvel. Além disso, os avanços na tecnologia de moldagem permitiram o desenvolvimento de soluções sob medidas com base em polímeros de silicone9. A viscosidade e a taxa de fluxo do líquido perfundido e a altura do canal principalmente determinam as características de tensão de cisalhamento do fluxo da perfusão dispositivo10. Neste artigo, apresentamos uma in vitro método para estudar os mecanismos subjacentes da adesão, de adesão e transmigração de leucócitos sob regimes de fluxo arterial e venoso. A vantagem dos métodos apresentados aqui é que eles podem ser executados usando um microscópio de fluorescência conectado a câmera comum e não exigem um experimentadores possuir alta proficiência técnica. O ensaio em vitro podem ser manipulado de várias maneiras (por exemplo, adicionando inibidores ou bloqueando os anticorpos) e, portanto, é aplicável em diferentes modelos de inflamação vascular e permite a investigação de adesão funções de proteína ou o avaliação de compostos específicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este ensaio em vitro é um método simples para investigar os mecanismos subjacentes de recrutamento de leucócitos durante a inflamação vascular, mas existem alguns pontos críticos a ser anotadas. O primeiro requisito para executar com êxito este ensaio é a perfusão de leucócitos sobre uma intacta e confluente vasculares ou monocamada de plaquetas. Isto pode ser conseguido pela prévia do revestimento das superfícies com colágeno tipo eu. Em geral, quando se trabalha com células vasculares primárias,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos os Drs Martin M. Schmitt e linha Fraemohs. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Holanda para a investigação científica (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Fundação para pesquisa de transfusão de sangue (LSBR n. º 1638) e Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) atribuído a R.R.K.
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
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