Laminar Flow-baseret Assays til at undersøge leukocyt ansættelse på kulturperler vaskulære celler og vedhængende blodplader
Summary
Leukocytter interagere begærligt med vaskulære celler og blodplader efter fartøjet væg skade eller under betændelse. Her, beskriver vi en ligetil laminar flow-baseret analyse for at karakterisere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for interaktioner mellem leukocytter og deres cellulære partnere.
Abstract
Ansættelse af leukocytter efter skade eller betændelse til steder af skade eller vævsskade er blevet undersøgt i løbet af de seneste årtier og har resulteret i begrebet leukocyt adhæsion cascade. Men de præcise molekylære mekanismer involveret i leukocyt rekruttering har endnu ikke blevet fuldt ud identificeret. Da leukocyt rekruttering er stadig et vigtigt emne i feltet af infektion, inflammation og (auto-) immune forskning, præsenterer vi en enkel laminar flow-baseret analyse at studere underliggende mekanismer af vedhæftning, nedtrapning vedhæftning, og transmigration af leukocytter under venøse og arterielle flow regimer. In vitro- analysen kan bruges til at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for interaktioner mellem leukocytter og deres cellulære partnere i forskellige modeller af vaskulære betændelse. Denne protokol beskriver en laminar flow-baseret analyse ved hjælp af en parallel-strømmen kammer og et omvendt fase kontrast mikroskop tilsluttet et kamera til at studere samspillet af leukocytter og endotelceller eller blodplader, som kan visualiseres og indspillede derefter analyseret offline. Endotelceller, blodplader eller leukocytter kan blive forbehandlet med hæmmere eller antistoffer til at bestemme rollen af specifikke molekyler under denne proces. Shear betingelser, dvs arteriel eller venøs shear stress, kan tilpasses nemt af viskositet og strømningshastigheden af de perfused væske og højden af kanalen.
Introduction
Skade, betændelse eller infektion svare leukocytter hurtigt til patogen – eller skade-associeret molekylære mønstre (PAMPs, DAMPs), ændre i en aktiveret tilstand, og flytte ud af blodet til lokaliteter af betændelse og vævsskader. Leukocytter evne til at interagere med deres cellulære og molekylære miljø er afgørende for deres korrekte funktion som immunceller, som fremhævet af genetiske sygdomme såsom leukocyt adhæsion mangel1. Leukocyt adhæsion har været genstand for intense undersøgelser i løbet af de seneste årtier, og dette har resulteret i begrebet leukocyt adhæsion kaskade i de tidlige 1990s2,3. Leukocyt adhæsion initieres selectin-medieret tilfangetagelsen af leukocytter til endotelet, forårsager celler til at rulle over den vaskulære overflade. Denne rullende gør det muligt for leukocytter at scanne for endotel-bundet vandrende stikord, fx, kemokiner, som inducerer aktivering af integriner. Efterfølgende, mægle de aktiverede integriner binding til endotel ligander, hvilket resulterer i fast leukocyt anholdelse. Leukocytter kan efterfølgende forberede extravasate af gennemgang og breder sig, før gennemtrængende i endothelial éncellelag og transmigrating i det underliggende væv. Det grundlæggende koncept for den kanoniske leukocyt kaskade har stort set uændret siden introduktionen, tilsat nogle mellemliggende trin4. Ikke desto mindre, de præcise molekylære mekanismer og roller for de mange aktører involveret i leukocyt rekruttering er ikke klarlagt hidtil, og leukocyt rekruttering forbliver et vigtigt emne i feltet af infektion, inflammation, og (auto) immun forskning.
For eksempel steg vaskulære inflammatoriske sygdomme som åreforkalkning, leukocyt rekruttering til fartøj væg drev plaque udvikling. Ustabile aterosklerotisk plaque kan briste, hvilket fører til massive aktivering af trombocytter og koagulation system, og efterfølgende okklusion af fartøjet5. Dette kan resultere i alvorlige kardiovaskulære udfald som myokardieinfarkt eller slagtilfælde. Derudover endotel denudation som det opstår klinisk, fx efter stent i en koronararterie, fører til et væld af samspillet af leukocytter og trombocytter til udsatte fartøj væg interiør (f.eks.matrix komponenter og glat muskel celler) og af leukocytter med blodplader dækker den vaskulære skade. Disse interaktioner er vigtigt for den videre udvikling af sygdommen som monocyt-trombocyttal interaktioner kan drive neointima dannelse6,7. Derudover trombocyt-leukocyt interaktioner medieret af leukocyt integrin Mac-1 (αMβ2) og trombocyttal GPIbα er for nylig blevet identificeret som roman drivere for trombose hos mus8.
Givet den bred tilgængelighed af menneskers og dyrs blod som en kilde af leukocytter og trombocytter for forskning, og det brede spektrum af isolerede matrix molekyler og udødeliggjort cellelinjer leukocyt og vaskulær oprindelse, er det muligt at simulere leukocyt interaktioner under flow i et laboratorium indstilling, ved hjælp af specialdesignede flow perfusion kamre. Mange varianter har udformet i de seneste årtier, lige fra vakuum-drevet til selvklæbende perfusion kamre. Alle varianter har til fælles, den immobile del (f.eks., kulturperler vaskulære celler eller matrix proteiner) er samlet i et større lækagesikre kammer udstyret med en pre-defineret kanal aktivering perfusion af væsker over den immobile del. Derudover aktiveret forskud i molding teknologi udvikling af skræddersyede løsninger baseret på silica polymerer9. Viskositet og strømningshastigheden af de perfused væske og højden af kanalen bestemmer hovedsagelig shear stress Karakteristik af flow perfusion enhed10. I denne artikel præsenterer vi en in vitro- metode til at studere underliggende mekanismer af vedhæftning, nedtrapning vedhæftning og transmigration af leukocytter under venøse og arterielle flow regimer. Fordelen ved de metoder, der præsenteres her er at de kan udføres ved hjælp af en fælles kamera tilsluttet fluorescens mikroskop, og kræver ikke en eksperimentatorer til besidder høje tekniske færdigheder. I vitro assay kan manipuleres på mange måder (f.eks.ved at tilføje hæmmere eller blokere antistoffer), og er således gældende i forskellige modeller af vaskulære betændelse og giver mulighed for undersøgelse af adhæsion protein funktioner eller den evaluering af særlige forbindelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne i vitro assay er en enkel metode til at undersøge underliggende mekanismer af leukocyt rekruttering under vaskulære betændelse, men der er nogle kritiske punkter skal bemærkes. Det første krav til udført dette assay er perfusion af leukocytter løbet en intakt og Konfluerende vaskulære eller trombocyttal éncellelag. Dette kan opnås ved forudgående belægning af overflader med kollagen type jeg. Generelt, når du arbejder med primære vaskulære celler, er det vigtigt at forsigtigt løsne celler v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Drs. Martin M. Schmitt og linje Fraemohs. Dette arbejde blev støttet af det nederlandske Institut for videnskabelig forskning (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Foundation for blodtransfusion forskning (LSBR Nr. 1638) og Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) tildeles R.R.K.
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
