Summary

Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

Published: April 09, 2018
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Summary

Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.

Abstract

Le recrutement des leucocytes à la blessure ou inflammation aux sites de blessures ou de dommages aux tissus a été étudié au cours de ces dernières décennies et a abouti à la notion de la cascade d’adhérence de leucocyte. Toutefois, l’exactes mécanismes moléculaires impliqués dans le recrutement des leucocytes n’ont pas encore été pleinement identifiés. Étant donné que le recrutement des leucocytes reste un sujet important dans le domaine de l’infection, l’inflammation et immunitaire recherche (auto-), nous présentons un simple test à flux laminaire pour étudier les mécanismes sous-jacents de l’adhérence, dé-adhérence, et transmigration des leucocytes en vertu des régimes d’écoulement veineux et artériels. L’essai in vitro peut être utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires dans différents modèles d’inflammation vasculaire. Ce protocole décrit une analyse axée sur les hottes à flux laminaire à l’aide d’une chambre à flux parallèle et un microscope à contraste de phase inversé relié à une caméra pour étudier les interactions des leucocytes et des cellules endothéliales ou les plaquettes, qui peuvent être visualisés et enregistrées puis analysés en mode hors connexion. Les cellules endothéliales, les plaquettes ou les leucocytes peuvent être prétraités avec inhibiteurs ou des anticorps afin de déterminer le rôle des molécules spécifiques au cours de ce processus. Conditions de cisaillement, contrainte de cisaillement c.-à-d. artériel ou veineux, peuvent être facilement adaptées par la viscosité et la vitesse d’écoulement des fluides perfusés et la hauteur du canal.

Introduction

Sur blessure, inflammation ou infection, leucocytes répondent rapidement à pathogène ou dommages associés à – molecular patterns (PAMPs, DAMPs), transformer un état activé et sortir de la circulation sanguine aux sites d’inflammation et tissus des dommages. La capacité des leucocytes d’interagir avec leur environnement cellulaire et moléculaire est essentielle pour leur bon fonctionnement comme des cellules immunitaires, mise en évidence par des maladies génétiques comme le déficit d’adhésion leucocytaire1. Adhésion leucocytaire a fait l’objet d’une enquête intense durant les dernières décennies, et il en est résulté dans le concept de la cascade d’adhérence de leucocyte dans le début des années 19902,3. Adhésion leucocytaire est initiée par la capture de sélectine médiée par des leucocytes à l’endothélium, provoquant les cellules à rouler sur la surface vasculaire. Ce roulement permet de leucocytes d’analyse pour l’endothélium lié aux indices migrateurs, par exemple, chimiokines, qui induisent l’activation des intégrines. Par la suite, les intégrines activés médient la liaison aux ligands endothéliales, entrainant l’arrestation de leucocyte ferme. Leucocytes puissent se préparer par la suite à extravasate en rampant et la diffusion, avant de pénétrer la monocouche endothéliale et transmigrant dans le tissu sous-jacent. Le concept de base de la cascade de leucocyte canonique a est restée pratiquement inchangée depuis son introduction, avec quelques étapes intermédiaires supplémentaire4. Néanmoins, les mécanismes moléculaires exacts et les rôles des nombreux joueurs impliqués dans le recrutement des leucocytes n’ont pas été clarifiées jusqu’à présent, et le recrutement des leucocytes reste un sujet important dans le domaine de l’infection, l’inflammation et (auto-) système immunitaire recherche.

Par exemple, au cours des maladies inflammatoires vasculaires telles que l’athérosclérose, augmenté le recrutement des leucocytes dans le développement de plaque bateau mur lecteurs. Les plaques d’athérome instables pourraient se rompre, menant à l’activation massive des plaquettes et du système de coagulation et par la suite à l’occlusion du vaisseau5. Cela peut entraîner des complications cardiovasculaires graves tels que l’infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral. En outre, dénudation endothéliale telle qu’elle se produit sur le plan clinique, par exemple après la pose d’un stent d’une artère coronaire, mène à une multitude d’interactions des leucocytes et des plaquettes à l’intérieur de mur de navire exposés (p. ex., constituants de la matrice et lisse cellules musculaires) et des leucocytes avec plaquettes couvrant les lésions vasculaires. Ces interactions sont importantes pour le développement ultérieur de la maladie, car les interactions monocyte-plaquettes pourraient conduire néo-intimale formation6,7. En outre, les interactions leucocyte-plaquettaire médiée par les leucocytes intégrine Mac-1 (Mde α β (2) et plaquettes GPIbα ont récemment été identifiées comme les nouveaux pilotes de thrombose chez les souris8.

Compte tenu de la grande disponibilité de sang humain et des animaux comme une source de leucocytes et de plaquettes pour la recherche et le large éventail des molécules de la matrice isolés et lignées cellulaires immortalisées de leucocytes et d’origine vasculaire, il est possible de simuler des leucocytes interactions dans un écoulement dans un laboratoire, en utilisant spécialement conçu chambres de perfusion de flux. De nombreuses variantes ont été conçus au cours des dernières décennies, allant d’une situation de vide aux chambres de perfusion auto-adhésives. Toutes les variantes ont en commun que la partie immobile (par exemple, des cellules vasculaires ou protéines de la matrice) est Assemblée dans une plus grande chambre étanche équipée d’un canal prédéfini permettant une perfusion de liquides sur la partie immobile. En outre, avances en technologie de moulage a permis le développement de solutions sur mesure basées sur silice polymères9. La viscosité et la vitesse d’écoulement des fluides perfusés et la hauteur du canal principalement déterminent les caractéristiques de contrainte de cisaillement des flux perfusion périphérique10. Dans cet article, nous présentons une méthode in vitro pour étudier les mécanismes sous-jacents de l’adhérence, dé-adhérence et la transmigration des leucocytes en vertu des régimes d’écoulement veineux et artériels. L’avantage des méthodes présentées ici est qu’elles peuvent être effectuées à l’aide d’un microscope à fluorescence caméra connectée commune et ne nécessitent pas un expérimentateur de posséder des compétences techniques élevées. L’essai in vitro peut être manipulée à bien des égards (par exemple, en ajoutant des inhibiteurs ou en bloquant les anticorps) et n’est donc applicable dans différents modèles d’inflammation vasculaire et permet l’enquête d’adhérence fonctions protéiques ou le évaluation de composés spécifiques.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’éthique médicale et Animal conseils éthiques d’Université de Maastricht. 1. flow-Based Test avec des cellules humaines Isolement des plaquettes du sang humain Prélever du sang veineux en anticoagulant citrate (3,2 %). Ajouter 1/15 volume d’acide Citrate Dextrose (ACD : citrate trisodique 80 mM, 52 mM d’acide citrique et 183 mM de glucose) dans le sang. Centrif…

Representative Results

Pour étudier l’adhésion endothéliale-leucocytaire, fluorescent étiquetés cellules THP-1 ont été perfusés pendant une monocouche endothéliale TNFα – ou non-stimulés pendant 2 min à 3 dyne/cm2. Le nombre total de cellules adhérentes de monocytaire a été déterminé après 2 min de perfusion en capturant 6 champs indépendants sur une période de 2 à 6 min. Les cellules adhérentes ont été quantifiés dans au moins 6 photos prises avec un microscope à contrast…

Discussion

Ce dosage in vitro est une méthode simple pour étudier les mécanismes sous-jacents de recrutement des leucocytes au cours de l’inflammation vasculaire, mais il y a certains points critiques à noter. La première condition pour réaliser avec succès ce test est la perfusion des leucocytes sur un intact et anastomosé vasculaires ou monocouche plaquettaire. Ceci peut être réalisé en enduisant préalable des surfaces avec du collagène de type I. En général, lorsque vous travaillez avec des cellules vas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les Drs Martin M. Schmitt et Fraemohs de la ligne. Ce travail a été soutenu par la Fondation néerlandaise pour la recherche scientifique (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Fondation pour la recherche sur la transfusion sanguine (LSBR Nr. 1638) et le Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) attribué à R.R.K.

Materials

Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE  world precision instruments 78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish corning 353001
50 mL syringe Becton Dickinson 300137
Silicone tubing  VWR 228-0700
Elbow Luer Connector Male Ibidi 10802
Female Luer Lock Coupler Ibidi 10823
Flow chamber University Hospital RWTH Aachen Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. 
Ibidi sticky slide VI 0.4 Ibidi 80608
Coverslips for sticky slides  Ibidi 10812
Collagen Type I, rat tail Life Technologies Europe bv A1048301
Recombinant Human TNF-α Peprotech 300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) Anaspec / Eurogentec 24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain Life Technologies Europe bv S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x Sigma-Aldrich Chemie H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid Life Technologies Europe bv 15630049
BUMINATE Albumin, 25%  Baxter 60010
Water for injection B. Braun 3624315
Calcium chloride dihydrate Merck 102382 
Magnesium chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich Chemie M2670
Apyrase Sigma-Aldrich Chemie A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Promocell GmbH C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) Promocell GmbH C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) ATCC  PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium  ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE ATCC PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) ATCC PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit ATCC PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926 ATCC CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ATCC 30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) ATCC CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1 DSMZ ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine Lonza BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 ATCC TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose Gibco 11965092
Accutase Promocell GmbH C-41310
Percoll Sigma-Aldrich Chemie P1644
Histopaque 1119 Sigma-Aldrich Chemie 11191
10x PBS Life Technologies Europe bv 14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin Becton Dickinson 367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%  Greiner Bio 455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water Sigma-Aldrich Chemie Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood

References

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Cite This Article
Vajen, T., Heinzmann, A. C., Dickhout, A., Zhao, Z., Nagy, M., Heemskerk, J. W., Koenen, R. R. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. J. Vis. Exp. (134), e57009, doi:10.3791/57009 (2018).

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