Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti
Summary
Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l’infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.
Abstract
Il reclutamento dei leucociti su lesioni o infiammazione ai siti di lesione o danno tissutale è stato studiato durante gli ultimi decenni ed ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita. Tuttavia, l’esatti meccanismi molecolari coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati ancora completamente identificati. Dal momento che il reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell’infezione, infiammazione e (auto-) ricerca immune, presentiamo un semplice test a flusso laminare per studiare meccanismi di fondo dell’aderenza, de-adesione, e trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. L’analisi in vitro può essere usata per studiare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulare in diversi modelli di infiammazione vascolare. Questo protocollo descrive un’analisi basata su flusso laminare usando una camera di flusso parallelo ed un microscopio invertito di contrasto di fase collegato ad una macchina fotografica per studiare le interazioni dei leucociti e cellule endoteliali o piastrine, che possono essere visualizzate e registrate poi analizzati non in linea. Le cellule endoteliali, piastrine o dei leucociti possono essere pretrattati con inibitori o anticorpi per determinare il ruolo di specifiche molecole durante questo processo. Condizioni di taglio, cioè arteriosi o venosi shear stress, possono essere facilmente adattate dalla viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l’altezza del canale.
Introduction
Alla ferita, infiammazione o infezione, il leucociti rispondono rapidamente all’agente patogeno o danni associata – molecolare modelli (PAMPs, DAMPs), cambiare in uno stato di attivazione e spostare fuori dal flusso di sangue ai siti di infiammazione e danno tissutale. La capacità dei leucociti per interagire con l’ambiente cellulare e molecolare è essenziale per la loro corretta funzione come cellule immuni, come evidenziato da malattie genetiche come l’adesione del leucocita carenza1. L’adesione del leucocita è stato oggetto di intensa ricerca nel corso degli ultimi decenni e ciò ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita nei primi anni 19902,3. L’adesione del leucocita è iniziata dalla cattura selectina-mediata dei leucociti all’endotelio, causando le cellule a rotolare sopra la superficie vascolare. Questo rotolamento permette di leucociti cercare spunti migratori endotelio associato, ad esempio, chemochine, che inducono l’attivazione delle integrine. Successivamente, le integrine attivate mediano l’associazione da ligandi endoteliali, con conseguente arresto del leucocita ferma. Leucociti successivamente possono preparare a MPEG strisciando e diffondendo, prima di penetrare il monostrato endoteliale e trasmigra in tessuto di fondo. Il concetto alla base della cascata del canonico del leucocita ha è rimasto pressoché invariato sin dalla sua introduzione, con alcuni passaggi intermedi aggiunto4. Tuttavia, i meccanismi molecolari esatti e i ruoli dei molti giocatori coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati chiariti finora, e reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell’infezione, infiammazione e (auto-) immuni ricerca.
Ad esempio, nel corso di malattie infiammatorie vascolari come l’aterosclerosi, aumentato reclutamento leucocitario nello sviluppo della placca vaso muro unità. Le placche aterosclerotiche instabili potrebbero rompersi, che conducono alla massiccia attivazione delle piastrine e del sistema di coagulazione e successivamente all’occlusione del vaso5. Ciò potrebbe comportare gravi esiti cardiovascolari come infarto miocardico o ictus. In più, per esempio dopo stenting di un’arteria coronaria, decumulazione endoteliali come esso si verifica clinicamente, conduce ad una moltitudine di interazioni dei leucociti e delle piastrine all’interno del muro vaso esposto (per esempio, componenti della matrice e liscio le cellule del muscolo) e dei leucociti con le piastrine che copre il danno vascolare. Queste interazioni sono importanti per l’ulteriore sviluppo della malattia come monociti e piastrine potrebbero guidare neointima formazione6,7. Inoltre, interazioni della piastrina-leucocitarie mediata da integrine leucocitarie Mac-1 (αMβ2) e della piastrina GPIbα sono state recentemente identificate come romanzo driver di trombosi in topi8.
Data l’ampia disponibilità di sangue umano e degli animale come fonte di leucociti e piastrine per la ricerca e l’ampio spettro di molecole di matrice isolato e linee cellulari immortalizzate di origine vascolare e del leucocita, è fattibile per simulare del leucocita interazioni in flusso in un laboratorio di impostazione, utilizzando appositamente progettato camere di aspersione di flusso. Molte varianti sono state progettate negli ultimi decenni, che vanno dal vuoto-driven agli alloggiamenti di aspersione autoadesiva. Tutte le varianti hanno in comune che la parte immobile (ad es., cellule vascolari coltivate o proteine della matrice) viene assemblata in una camera più grande di tenuta dotata di un pre-definito canale consentendo la perfusione di liquidi sopra la parte immobile. Inoltre, gli avanzamenti nella tecnologia di stampaggio permesso lo sviluppo di soluzioni su misura basate su silice polimeri9. La viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l’altezza del canale principalmente di determinare le caratteristiche di sollecitazione di taglio del flusso perfusione periferica10. In questo articolo, presentiamo un metodo in vitro per lo studio dei meccanismi sottostanti dell’aderenza, de-adesione e la trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. Il vantaggio dei metodi presentati qui è che può essere eseguite utilizzando un microscopio a fluorescenza lecamera comune e non richiedono un sperimentatori di possedere alta competenza tecnica. Il saggio in vitro può essere manipolato in vari modi (ad esempio, l’aggiunta di inibitori o bloccando gli anticorpi) e così è applicabile a diversi modelli di infiammazione vascolare e permette l’indagine su adesione le funzioni della proteina o la valutazione di specifici composti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo test in vitro è un semplice metodo per indagare i meccanismi di reclutamento leucocitario durante l’infiammazione vascolare, ma ci sono alcuni punti critici deve essere notato. Il primo requisito per eseguire correttamente questo dosaggio è la perfusione dei leucociti sopra un intatto e confluenti vascolari o monostrato di piastrine. Questo può essere ottenuto previo rivestimento delle superfici con collagene di tipo I. In generale, quando si lavora con cellule primarie vascolari, è importante staccar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la d. ssa Martin M. Schmitt e linea Fraemohs. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Paesi Bassi per la ricerca scientifica (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Fondazione per la ricerca di trasfusione di sangue (LSBR Nr. 1638) e Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) assegnato a r.r.k.
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
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