Laminær strømning-baserte analyser undersøke leukocytter rekruttering på kulturperler vaskulære celler og tilhenger blodplater
Summary
Leukocytter samhandle ivrig med vaskulære celler og blodplater etter fartøyet veggen skade eller under betennelse. Her beskriver vi en enkel laminær strømning-baserte analysen betegner molekylære mekanismer underlie samspillet mellom leukocytter og deres cellular partnere.
Abstract
Rekruttering av leukocytter skade eller betennelse områder for skade eller skade på vev har blitt undersøkt i løpet av de siste tiårene, og har resultert i begrepet leukocytter vedheft cascade. Men nøyaktig molekylære mekanismer involvert i leukocytter rekruttering ennå ikke blitt fullt har identifisert. Siden leukocytter rekruttering fortsatt et viktig tema innen infeksjon og betennelse (auto-) immun forskning, presenterer vi en enkel laminær strømning-baserte analysen studere underliggende mekanismene vedheft, de vedheft, og Transmigration av leukocytter under venøs og arteriell regimer. I vitro analysen kan brukes å studere molekylære mekanismer underlie samspillet mellom leukocytter og deres cellular partnere i forskjellige modeller av vaskulær betennelse. Denne protokollen beskriver en laminær strømning-baserte analysen ved hjelp av en parallell-flow chamber og en invertert fase kontrast mikroskop koblet til et kamera for å studere samspillet av leukocytter og endotelceller eller blodplater, som kan visualisere og spilt inn så analysert frakoblet. Endotelceller, blodplater eller leukocytter kan være forbehandlet med hemmere eller antistoffer finne rollen bestemt molekyler under denne prosessen. Skjær forhold, dvs venøs eller arteriell skjæring stress, kan lett tilpasses av viskositet og strømningshastighet på perfused væsker og høyden på kanalen.
Introduction
Ved skade, betennelse eller infeksjon reagere leukocytter raskt til patogen – eller skader-forbundet molekylær mønster (PAMPs, DAMPs), endre til en aktivert tilstand, og flytte ut av blodstrømmen til områder av betennelse og vev skade. Evne til leukocytter å samhandle med omgivelsene cellulære og molekylære er viktig for deres fungerer som immunceller, som fremhevet av genetiske lidelser som leukocytter vedheft mangel1. Leukocytter vedheft har vært gjenstand for intens granskning i løpet av de siste tiårene, og dette har ført til begrepet leukocytter vedheft gjennomgripende i tidlig på 1990-tallet2,3. Leukocytter vedheft er initiert av selectin mediert erobringen av leukocytter til endotelet, forårsaker cellene til å rulle over vaskulær overflaten. Dette rullende kan leukocytter skanne for endotelet-bundet vandrende Stikkordene, f.eks, chemokines, som induserer aktivering av integrins. Deretter megle aktivert integrins bindingen til endothelial ligander, resulterer i fast leukocytter arrestasjon. Leukocytter kan deretter forberede til extravasate ved gjennomgang og spre, gjennomtrengende endotelial monolayer og transmigrating til underliggende vev. Det grunnleggende konseptet av kanoniske leukocytter kaskade har vært stort sett uendret siden introduksjonen, med noen mellomliggende trinn lagt4. Likevel nøyaktig molekylære mekanismer og rollene til de mange spillerne involvert i leukocytter rekruttering har ikke avklart hittil, og leukocytter rekruttering er fortsatt et viktig tema innen infeksjon, betennelser og (auto-) immun forskning.
For eksempel økt under vaskulær inflammatoriske sykdommer som aterosklerose, leukocytter rekruttering til fartøyet veggen stasjoner plakk utvikling. Ustabil aterosklerotisk plaketter kan brudd, fører til massiv aktivering av blodplater og koagulering systemet og okklusjon av fartøyet5. Dette kan resultere i alvorlig hjerte resultater som hjerteinfarkt eller hjerneslag. I tillegg endotelial denudation som det oppstår klinisk, f.eks etter stenting av en koronar, fører til en rekke interaksjoner av leukocytter og blodplater til utsatte fartøyet veggen interiøret (f.eks, matrix komponenter og glatt muskel celler) og av leukocytter med blodplater dekker vaskulære skader. Disse interaksjonene er viktig for videre utvikling av sykdommen som monocytt-Platederivert interaksjoner kan kjøre neointima formasjon6,7. I tillegg blodplater-leukocytter interaksjoner formidlet av leukocytter integrin Mac-1 (αMβ2) og blodplater GPIbα har nylig blitt identifisert som roman driverne av tromboser i mus8.
Gitt bred tilgjengelighet for mennesker og dyr blod som leukocytter og blodplater for forskning og bredt spekter av isolerte matrix molekyler og udødeliggjort linjer av leukocytter og vaskulær opprinnelse, er det mulig å simulere leukocytter samhandlingene under flyt i et laboratorium innstilling, bruker spesialdesignet flyt perfusjon kamre. Mange varianter har utviklet over de siste tiårene, alt fra vakuum-drevet til selvklebende perfusjon kamre. Alle varianter har til felles at delen immobile (f.eks, kultivert vaskulære celler eller matrix proteiner) settes sammen til en større lekkasjefri kammer utstyrt med en forhåndsdefinert kanal aktivere perfusjon av væsker over delen immobile. I tillegg aktivert fremskritt i molding teknologien utvikling av skreddersydde løsninger basert på silica polymerer9. Viskositet og strømningshastighet på perfused væsker og høyden på kanalen bestemmer hovedsakelig skjæring stress kjennetegner flyt perfusjon enhet10. I denne artikkelen presenterer vi en i vitro metoden å studere underliggende mekanismene vedheft, de vedheft og transmigration av leukocytter under venøs og arteriell regimer. Fordelen av metodene presenteres her er at de utføres med et vanlig kamera koblet fluorescens mikroskop og krever ikke en forskere å ha høy teknisk kompetanse. I vitro analysen kan manipuleres i mange måter (f.eksved å legge hemmere eller blokkerer antistoffer), og gjelder dermed i forskjellige modeller av vaskulær betennelse og lar etterforskningen av vedheft protein funksjoner eller evaluering av bestemte forbindelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne i vitro analysen er en enkel metode å undersøke underliggende mekanismene av leukocytter rekruttering under vaskulær betennelse, men det er noen kritiske punkter skal noteres. Det første kravet for å kunne utføre denne analysen er perfusjon av leukocytter over en intakt og confluent vaskulære eller blodplater monolayer. Dette kan oppnås ved tidligere belegg av overflater med kollagen type jeg. Vanligvis når du arbeider med primære vaskulære celler, er det viktig å forsiktig koble celler ved hje…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Martin M. Schmitt og linjen Fraemohs. Dette arbeidet ble støttet av Nederland grunnlaget for vitenskapelig forskning (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner stiftelse for blodoverføring forskning (LSBR Nr. 1638) og Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) til R.R.K.
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
