שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח-לתא בהעברת מידע מתנדנדות על ידי שליטה optogenetic ולחיות ניטור של ביטוי גנים. גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות רב תאיים.
Abstract
תאים צריך להגיב כראוי חנותם לסביבות משתנות, אשר מושפעים על ידי גורמים שונים של תאים המקיפים אותם. החריץ איתות הוא אחד כזה מכונות מולקולריות חיוני עבור תקשורת לתא, אשר ממלא את תפקידי המפתח בהתפתחות נורמלית של העוברים. מסלול זה כרוכה לתא העברה של מידע מתנדנדות עם מקצבים ultradian, אך למרות ההתקדמות בטכניקות ביולוגיה מולקולרית, זה מאתגר התירי את ההשפעה של אינטראקציות multicellular על ג’ין מתנדנדות דינמיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר optogenetic בקרה ופיקוח בשידור חי דפוסי ביטוי גנים באופן זמני מדויק. שיטה זו חשף בהצלחה תשומות תקופתיים תאיים, המערכת של חריץ איתות entrain תנודות מהותי על ידי תדר כוונון שלב הסטה ברזולוציה תא בודד. גישה זו ישימה על הניתוח של המאפיינים דינמי של איתות המסלולים השונים, מתן פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות multicellular.
Introduction
תקשורת לתא לשחק תפקידים חיוניים המתבנת עובריים בתהליכים התפתחותיים. ב העוברים בעלי. החוליות, המבנים metameric הנקרא somites נוצרות לאורך הציר הקדמי-אחוריים הגוף עם דיוק טמפורלית מדויק תחת השליטה של שעון זמן, קרא את השעון של פילוח1. במהלך תהליך זה, קבוצה של תאים presomitic והמזודרם (PSM) מעת לעת מומרים somites באופן סינכרוני. תהליך זה דורש ביטוי גנים מתנדנדות מסונכרן ויוצרים תאים PSM נעים בשלב של somites אותו. התקופה של ביטוי גנים מתנדנדות היא בסביבות 2-3 h בעכברים, בערך 30 דקות של דג זברה. הפומבית, PSM התאים מאבדים את2,synchrony3, אך כאשר הם צבורים מחדש, הם יכולים לארגן את עצמי, לשחזר את האוכלוסייה synchrony4, רומז תא-תא צימוד הוא מפתח מסונכרן תנודות.
המאמצים חשף כי מולקולות איתות בשביל חריץ דלתא מחוברים בחוזקה תנודות מסונכרן של גנים שעון פילוח. מעכבי תרופתי או מוטציות גנטיות של חריץ איתות בטל סינכרון האוכלוסייה מתנדים. דג זברה מוטנטים של חריץ איתות רכיבים, כגון DeltaC, DeltaD, Notch1a, להציג תנודות אסינכרוני5,6. עוברי צ’יק או עכבר, לא רק של ליגנד חריץ דלתא-like1 (Dll1), אלא גם הציצית החריץ אפנן המטורף (Lfng) נדרש תנודות מסונכרן7,8,9. עם זאת, זה קשה לבחון את יכולת תפקודית של מולקולות כאלה להעברת מידע דינאמי מתא לתא, כי החלטות הטמפורלי של ההפרעות המקובלת של ג’ין תקנה דינמיקה לא היו מספיק כדי לחקור תהליכים של צירי זמן של 2-3 h (מקצבים ultradian).
לאחרונה פיתחנו שיטה משולבת כדי לשלוט ולפקח ג’ין ביטוי תבניות תאים בתרבית של10. טכנולוגיה זו מאפשרת אינדוקציה של פולסים ביטוי הגן על ידי תאורה אור תקופתיים על פרקי זמן ultradian. פרוטוקול זה מייצג את שיטות ליצור שורות תאים פוטוסנסיטיבית ולבחון תגובות דינמי של הכתב תאים על ידי הפריה חוץ גופית לחיות תאים ניטור בהקשרים של התקשורת לתא. שיטה זו ישימה על הניתוח של רבים אחרים איתות המסלולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הראנו שיטה לשליטה dynamics ביטוי גנים עם תקופתיות של 2-3 h… סרגל הזמן הזה הוא הרבה יותר קצר מאשר אלה במערכות אחרות המקובלת, כולל מערכת ט’-על מערכת בכוכב המקורי. פרמטרים מרכזיים כדי להגיע בזמן ultradian-המאזניים הם מחצית החיים של צילום-induced מוצרים מולקולרית, mRNAs חלבונים. פרמטרים אלה קינטי עשוי תלויים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך על ידי JST, פרסטו (מלאכותית), ליבת המחקר אבולוציונית למדע וטכנולוגיה (JPMJCR12W2 (ר. ק)) מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן 26119708 (אינטליגנציה מלאכותית) ו- 16 H 06480 (ר. ק)), מדעי מחקר (א) (יפן החברה לקידום המדע (JSPS) 24240049 (ר. ק)), מדענים צעירים (א) (JSPS H 15 05326 (אינטליגנציה מלאכותית)), ואת מענק של הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים “זריחה חי הדמיה”של MEXT, יפן, פלטפורמה עבור גישות דינאמיות למערכת חיים מ MEXT, יפן.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
