제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드
Summary
여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.
Abstract
셀은 일시적으로 셀 주변에서 다양 한 요인에 의해 영향을 환경 변화에 제대로 응답 해야 합니다. 노치 신호 전달 경로 같은 필수 분자 기계 셀 통신, 태아의 정상적인 발전에 핵심 역할 중 하나입니다. 이 통로 포함 ultradian 리듬, 진동 정보 셀을 전송 하지만 분자 생물학 기술에 있는 진도도 불구 하 고 그것은 되었습니다 도전 진동 유전자에 다세포 상호 작용의 영향을 명료 하 게 역학입니다. 여기, 우리는 optogenetic 제어 및 정확한 시간적으로 유전자 표현 패턴을 라이브 감시를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 메서드는 성공적으로 노치 신호의 세포내와 세포 주기 입력 기본 진동 주파수 튜닝 및 위상 단일 셀 해상도에서 이동 하 여 끌고가 다 밝혔다. 이 방식은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 하는 다양 한 신호 통로의 동적 특징의 분석에 적용 합니다.
Introduction
셀 통신 발달 과정에서 배아 패턴에 중요 한 역할을 재생합니다. 척추 동물 배아 metameric 구조 somites 라는 세분화 시계1시간 유지 시계의 통제 정확한 시간 정확도 이전 후부 몸 축 형성 된다. 이 과정 presomitic mesoderm (PSM) 세포의 그룹 동기 방식에서 somites로 주기적으로 변환 됩니다. 이 프로세스 동기화 진동 유전자 발현 포함 하 고 단계에 진동 하는 PSM 셀 같은 somites 형성. 진동 유전자 발현의 기간은 약 2 ~ 3 h 쥐와 제 브라에서 약 30 분입니다. 해리, PSM 셀 손실 synchrony2,3, 하지만 그들은 다시 집계 하는 때, 그들은 자체 구성 하 고 인구 synchrony4, 셀 커플링 하자는 동기화에 대 한 키 복구 진동입니다.
광범위 한 노력 델타-노치 통로 신호 분자 세분화 시계 유전자의 동기화 된 진동에 단단히 연결 되어 있는지 밝혀. 약리학 억제제 또는 노치 신호의 유전자 변이 발진기의 인구 desynchronize. Zebrafish, 노치 신호 구성 요소, DeltaC, DeltaD, Notch1a, 등의 돌연변이 비동기 진동5,6표시 합니다. 여자 또는 마우스 배아에서 노치 ligand 델타-like1 (Dll1) 뿐만 아니라 노치 변조기 미치광이 프린지 (Lfng)는 동기화 된 진동7,,89필요 합니다. 그러나 유전자 규칙 역학의 기존의 섭 동의 시간적 해상도 조사 하는 데 충분 하지 않았기 때문에, 그것은 셀을 동적 정보 전송에 대 한 이러한 분자의 기능 기능을 테스트 하기 어려운 되었습니다는 2-3 h (ultradian 리듬)의 계획의 프로세스.
최근 포유류 세포10제어 및 모니터 유전자 표현 패턴을 통합된 방법을 개발 했습니다. 이 기술은 ultradian 시간의 척도에 주기적인 빛 조명에 의해 유도를 유전자 식 펄스의 수 있습니다. 이 프로토콜은 감광 세포 선 확립 및 라이브 셀 발광 셀 통신의 문맥에서 모니터링 하 여 기자 세포의 동적 응답을 관찰 하는 방법을 나타냅니다. 이 방법은 많은 다른 신호 통로의 분석에 적용 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 유전자 식 역학 2 ~ 3 h의 주기를 제어 하는 방법을 보였다. 이 시간 단위 Tet에 시스템 및 원래 LightOn 시스템을 포함 하 여 다른 기존 시스템에 있는 것 들 보다 훨씬 짧습니다. Ultradian 시간의 척도 도달 주요 매개 변수는 분자 제품 사진 유도, mRNAs 및 단백질의 반감기. 이러한 운동 매개 변수 세포 유형 및 종에 달려 있습니다. 활동을 조정에 대 한 다른 시퀀스 Hes1 3′ UTR 대체 시퀀스 및 대상 단?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 진화 과학 및 기술 (JPMJCR12W2 (R.K.)), 과학 연구 혁신 분야 (교육, 문화, 스포츠, 과학, 및 기술 (MEXT), 일본에 대 한 특정 JST, 프레스 토 (A.I.), 핵심 연구에 의해 지원 되었다 26119708 (A.I.) 및 16 H 06480 (R.K.)), 과학 연구 (A) (일본 사회 과학 (JSP) 24240049의 승진에 대 한 (R.K.)), 그리고 젊은 과학자 (A) (JSP 15 H 05326 (A.I.)), 그리고 혁신적인 지역 “형광에 대 한 과학적 연구에 대 한 특정 라이브 이미지 “문 부 과학성, 일본, 그리고 플랫폼의 동적 접근에 대 한 생활 시스템을 문 부 과학성, 일본에서에서입니다.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
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