أسلوب أوبتوجينيتيك لمراقبة وتحليل أنماط التعبير الجيني في تفاعلات الخلية للخلية
Summary
نقدم هنا، بروتوكول تحليل خلية إلى نقل المعلومات متذبذبة بالتحكم أوبتوجينيتيك والعيش الرصد للتعبير الجيني. هذا النهج يوفر منبرا فريداً لاختبار دلالة وظيفية البرامج تعبير الجينات الحيوية في أنظمة متعددة الخلايا.
Abstract
ينبغي أن تستجيب الخلايا بشكل صحيح للبيئات، التي تتأثر بعوامل مختلفة من المحيطة بالخلايا المتغيرة وقتيا. الشق مما يشير إلى المسار هو واحد من هذه الآلية الجزيئية الأساسية للاتصالات خلية إلى خلية، والذي يلعب دوراً رئيسيا في التطور الطبيعي للأجنة. هذا المسار ينطوي نقل خلية إلى خلية المعلومات متذبذبة مع إيقاعات أولتراديان، ولكنه على الرغم من التقدم المحرز في تقنيات البيولوجيا الجزيئية، وقد تم تحديا لتوضيح أثر التفاعلات متعددة الخلايا في الجينات متذبذبة ديناميات. نقدم هنا، على بروتوكول يسمح بالتحكم أوبتوجينيتيك ويعيش رصد أنماط التعبير الجيني بطريقة زمنية محددة. وكشف هذا الأسلوب بنجاح أن مدخلات دورية داخل الخلايا وبين الخلايا مما يشير إلى درجة انترين ذبذبات الجوهرية بمرحلة تحول في القرار خلية واحدة وضبط التردد. وهذا النهج ينطبق على تحليل السمات الدينامية لمختلف مسارات الإشارات، توفير منصة فريدة لاختبار دلالة وظيفية البرامج تعبير الجينات الحيوية في أنظمة متعددة الخلايا.
Introduction
خلية إلى خلية الاتصالات تلعب أدواراً حاسمة في الزخرفة الجنينية في العمليات الإنمائية. في أجنة الفقاريات، تتشكل هياكل ميتاميريك يسمى سميتس على طول المحور الأمامي الخلفي الجسم مع دقة زمنية دقيقة تحت مراقبة على مدار الساعة حفظ الوقت، يسمى تجزئة عقارب الساعة1. أثناء هذه العملية، يتم تحويل مجموعة من الخلايا بريسوميتيك mesoderm (PSM) دورياً إلى سميتس على نحو متزامن. تنطوي هذه العملية على التعبير الجيني متذبذبة متزامنة والخلايا PSM أن يتذبذب في مرحلة تشكل سميتس نفسه. وفترة التعبير الجيني متذبذبة حوالي 2 إلى 3 ح في الفئران وحوالي 30 دقيقة في الزرد. عند فصله، تفقد الخلايا PSM التزامن2،3، ولكن عندما تكون إعادة تجميعها، يمكن تنظيم ذاتي واسترداد السكان تتسق4، مما يوحي بأن اقتران خلية خلية مفتاح متزامنة ذبذبات.
كشفت الجهود المكثفة أن إشارات الجزيئات في مسار دلتا-الدرجة متصلة محكم بذبذبات متزامنة من الجينات على مدار الساعة تجزئة. أما مثبطات الدوائية أو طفرات وراثية من الدرجة الأولى مما يشير إلى لﻻستخدام سكان التذبذب. في الزرد، عرض طفرات من الدرجة الأولى مما يشير إلى عناصر، مثل ديلتاك وديلتاد و Notch1a، ذبذبات غير متزامن5،6. في الأجنة الفرخ أو الماوس، يجند الشق دلتا-like1 (Dll1) ليس فقط، بل أيضا هامش “حز المغير مجنونة” (لفنج) مطلوب لذبذبات متزامنة7،،من89. ومع ذلك، كان من الصعب لاختبار القدرة الوظيفية لهذه الجزيئات لنقل المعلومات الحيوية من خلية إلى أخرى، نظراً لأن قرارات مؤقتة من اضطراب التقليدية لديناميات تنظيم الجينات لم تكن كافية للتحقيق العمليات لفترات زمنية من 2-3 ح (إيقاعات أولتراديان).
قمنا مؤخرا بتطوير أسلوب متكامل لمراقبة ورصد أنماط التعبير الجيني في خلايا الثدييات10. هذه التكنولوجيا تمكن الاستقراء البقول التعبير الجيني بالإضاءة الخفيفة دورية على جداول زمنية أولتراديان. ويمثل هذا البروتوكول الأساليب إنشاء خطوط الخلايا حساس ومراقبة ردود دينامية للخلايا مراسل التﻷلؤ خلية يعيش الرصد في السياقات من خلية إلى خلية الاتصالات. هذا الأسلوب المنطبق على تحليل العديد من مسارات الإشارات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد أظهرنا أسلوب لمراقبة ديناميات التعبير الجيني مع دورية ح 2 إلى 3. هذا الجدول الزمني أقصر بكثير من تلك الموجودة في النظم التقليدية الأخرى، بما في ذلك تيت في النظام ونظام ليتون الأصلي. المحددات الأساسية للوصول إلى المقاييس الزمنية أولتراديان إنصاف المستحثة بصور المنتجات الجزيئية ومرناس ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها JST، المعزوفة (بالنيابة)، والبحوث الأساسية افولوشونال العلوم والتكنولوجيا (JPMJCR12W2 ())، معونات “البحث العلمي” في “مجالات مبتكرة” (وزارة التربية والتعليم والثقافة، والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون)، اليابان 26119708 (بالنيابة) و 16 ح 06480 ())، والعلمية البحث (أ) (جمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) 24240049 ())، والعلماء الشباب (A) (JSPS ح 15 05326 (بالنيابة))، ومعونات للبحث العلمي في مجالات مبتكرة “الأسفار لايف “يأمرون، واليابان، ومنهاج للتصوير” النهج الديناميكي “” النظام الذين يعيشون “من يأمرون، اليابان.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
