Une méthode Optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’Expression génique dans les Interactions cellule-cellule
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à analyser le transfert de cellule à cellule de renseignements oscillatoires par optogenetic contrôle et suivi de l’expression génique en direct. Cette approche constitue une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.
Abstract
Cellules doivent répondre correctement à l’évolution dans le temps des environnements qui sont influencés par divers facteurs d’entourant les cellules. L’encoche voie de signalisation est l’une de ces machines moléculaires essentielles pour les communications de cellule à cellule, qui joue un rôle clé dans le développement normal des embryons. Cette voie implique un transfert de cellule à cellule d’informations oscillatoires avec rythme ultradien, mais malgré les progrès des techniques de biologie moléculaire, il a été difficile à élucider l’impact des interactions multicellulaires sur gène oscillatoire dynamique. Nous présentons ici un protocole qui permet le contrôle d’optogenetic et de surveillance en direct des modèles d’expression de gène de manière temporelle précise. Avec succès, cette méthode a révélé que les entrées périodiques intracellulaires et intercellulaires de signalisation Notch monter oscillations intrinsèques de réglage de fréquence et déphaseurs à la résolution de cellule unique. Cette approche est applicable à l’analyse des caractéristiques dynamiques des différentes voies de signalisation, fournissant une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.
Introduction
Cellule-cellule communication joue un rôle crucial dans la structuration embryonnaire dans le processus de développement. Chez les embryons de vertébrés, les structures métamérique appelées somites sont forment le long de l’axe antéro-postérieur corps avec une précision temporelle sous le contrôle d’une horloge de chronométrage, appelée la segmentation horloge1. Au cours de ce processus, un groupe de cellules somitiques mésoderme (PSM) sont périodiquement convertis en somites de manière synchrone. Ce processus implique l’expression des gènes oscillatoire synchronisé et cellules PSM qui oscillent en phase forment les somites mêmes. La période de l’expression génique oscillatoire est environ 2 à 3 h chez la souris et environ 30 min chez le poisson zèbre. Lorsque dissociées, les cellules PSM perdent la synchronie2,3, mais quand ils sont re-agrégés, qu’ils puissent s’organiser et récupérer la population synchronie4, ce qui suggère que le couplage cellule-cellule est une clé pour la synchronisation oscillations.
Des efforts considérables ont révélé que des molécules de signalisation de la voie Delta-encoche sont correctement raccordés aux oscillations des gènes segmentation horloge synchronisées. Inhibiteurs pharmacologiques ou mutations génétiques de la signalisation Notch désynchroniser la population des oscillateurs. Chez le poisson zèbre, mutants de Notch signalisation composants, tels que DeltaC, DeltaD et Notch1a, affichent les oscillations asynchrone5,6. Chez les embryons de poulet ou de la souris, non seulement le ligand Notch Delta-like1 (Dll1), mais aussi l’encoche modulateur Lunatic fringe (LNFG) est nécessaire pour des oscillations synchronisées7,8,9. Cependant, il a été difficile à tester la capacité de telles molécules pour le transfert des informations dynamiques de cellule en cellule, parce que des résolutions temporelles des classique perturbation de la dynamique de règlement de gène n’étaient pas suffisantes pour enquêter sur les processus de délais de 2 à 3 h (rythme ultradien).
Nous avons récemment mis au point une méthode intégrée pour contrôler et surveiller profils d’expression génique dans les cellules de mammifères,10. Cette technologie permet l’induction d’impulsions d’expression de gène par une illumination lumineuse périodique sur des échelles de temps ultradiennes. Ce protocole représente les méthodes pour établir des lignées de cellules photosensibles et observer les réactions dynamiques des cellules journaliste par luminescence de cellules vivantes suivi dans les contextes de communication de cellule à cellule. Cette méthode est applicable à l’analyse des nombreuses autres voies de signalisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons montré une méthode pour contrôler la dynamique d’expression de gène avec une périodicité de 2 à 3 h. Cette échelle de temps est plus courte que ceux dans d’autres systèmes conventionnels, y compris le système Tet et le système de LightOn original. Les paramètres clés pour atteindre les échelles de temps ultradiennes sont demi-vies de produits moléculaires photoinduit, ARNm et de protéines. Ces paramètres cinétiques peuvent dépendre des espèces et des types de cellules. Pour le réglage …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par JST, PRESTO (par intérim), les recherches de base évolutif des sciences et technologies (JPMJCR12W2 (R.K.)), subventions pour la recherche scientifique sur les régions innovantes (ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT), Japon 26119708 (par intérim) et 16 H 06480 (R.K.)), scientifique (A) (société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS) 24240049 (R.K.)), de recherche et jeunes scientifiques (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)) et une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants « Fluorescence Direct d’imagerie » du MEXT, Japon et plate-forme pour des approches dynamiques au système vivant depuis le MEXT, Japon.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
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