एक Optogenetic विधि को नियंत्रित करने और सेल में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने वाली सेल बातचीत
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान optogenetic नियंत्रण और जीन अभिव्यक्ति के रहते निगरानी द्वारा थरथरानवाला जानकारी के सेल के हस्तांतरण का विश्लेषण करने के लिए प्रस्तुत करते हैं । यह दृष्टिकोण कोशिकीय प्रणालियों में गतिशील जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों के एक कार्यात्मक महत्व का परीक्षण करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है ।
Abstract
कोशिकाओं को अस्थाई रूप से बदलने के वातावरण, जो आसपास के कोशिकाओं से विभिंन कारकों से प्रभावित कर रहे है ठीक से जवाब देना चाहिए । पायदान संकेतन मार्ग सेल के लिए ऐसी आवश्यक आणविक मशीनरी में से एक है करने वाली सेल संचार, जो भ्रूण के सामांय विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इस मार्ग ultradian लय के साथ थरथरानवाला जानकारी के एक सेल के लिए सेल हस्तांतरण शामिल है, लेकिन आणविक जीव विज्ञान की तकनीक में प्रगति के बावजूद, यह थरथरानवाला जीन पर कोशिकीय बातचीत के प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो गया है dynamics. यहां, हम एक सटीक लौकिक तरीके से optogenetic नियंत्रण और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के रहने की निगरानी परमिट एक प्रोटोकॉल मौजूद । इस विधि सफलतापूर्वक आवृत्ति ट्यूनिंग और चरण एकल-कक्ष रिज़ॉल्यूशन पर स्थानांतरण द्वारा पायदान संकेतन चढ़ना आंतरिक दोलनों की कि intracellular और सेलुलर आवधिक आदानों से पता चला. यह दृष्टिकोण कोशिकीय प्रणालियों में गतिशील जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों के एक कार्यात्मक महत्व का परीक्षण करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करने, विभिन्न सिग्नलिंग रास्ते की गतिशील सुविधाओं के विश्लेषण के लिए लागू है.
Introduction
सेल के लिए सेल संचार विकास प्रक्रियाओं में भ्रूण नमूनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । हड्डीवाला भ्रूण में, metameric संरचनाओं बुलाया somites पूर्वकाल के साथ गठन कर रहे हैं-पीछे एक सटीक लौकिक सटीकता के साथ एक समय रखने घड़ी के नियंत्रण के अंतर्गत शरीर धुरी, फॉल्ट घड़ी1कहा जाता है. इस प्रक्रिया के दौरान, presomitic मध्य त्वक स्तर (PSM) कक्षों का एक समूह में सिंक्रोनस तरीके से somites में परिवर्तित समय है । इस प्रक्रिया सिंक्रनाइज़ थरथरानवाला जीन अभिव्यक्ति और PSM कोशिकाओं है कि चरण में दोलन के रूप में एक ही somites शामिल हैं । थरथरानवाला जीन अभिव्यक्ति की अवधि के आसपास चूहों में 2 से 3 ज और zebrafish में के बारे में 30 मिनट है । जब असंबद्ध, PSM कोशिकाओं synchrony2,3खो, लेकिन जब वे फिर से एकत्रित कर रहे हैं, वे स्वयं को संगठित करने और जनसंख्या synchrony4की वसूली कर सकते हैं, सुझाव है कि सेल-सेल युग्मन सिंक्रनाइज़ के लिए एक महत्वपूर्ण है दोलनों.
व्यापक प्रयासों से पता चला कि डेल्टा पायदान मार्ग में अणुओं संकेत कसकर विभाजन घड़ी जीन के सिंक्रनाइज़ दोलनों से जुड़े हैं । या तो औषधीय अवरोधकों या पायदान संकेत के आनुवंशिक उत्परिवर्तनों oscillators की आबादी को सिंक्रनाइज़. zebrafish में, DeltaC, डेल्टा, और Notch1a जैसे पायदान संकेतन घटकों के म्यूटेंट, एसिंक्रोनस दोलनों5,6प्रदर्शित करें । लड़की या माउस भ्रूण में, न केवल पायदान ligand डेल्टा-like1 (Dll1) लेकिन यह भी पायदान मॉडुलन पागल फ्रिंज (Lfng) सिंक्रनाइज़ दोलनों के लिए आवश्यक है7,8,9. तथापि, यह गया है सेल से गतिशील सूचना हस्तांतरण के लिए सेल के लिए इस तरह के अणुओं के कार्यात्मक क्षमता परीक्षण मुश्किल है, क्योंकि जीन विनियमन गतिशीलता के पारंपरिक गड़बड़ी के लौकिक संकल्प की जांच करने के लिए पर्याप्त नहीं थे २-३ ज (ultradian लय) के timescales की प्रक्रियाएँ.
हमने हाल ही में स्तनधारी कोशिकाओं10में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को नियंत्रित करने और मॉनीटर करने के लिए एक एकीकृत विधि विकसित की है । इस प्रौद्योगिकी ultradian समय तराजू पर आवधिक प्रकाश रोशनी से जीन अभिव्यक्ति दालों की प्रेरण सक्षम बनाता है । यह प्रोटोकॉल सहज कक्ष-रेखाओं को स्थापित करने की विधियों का प्रतिनिधित्व करता है और सेल-टू-सेल संचार के संदर्भों में लाइव-सेल luminescence मॉनिटरिंग द्वारा रिपोर्टर कक्षों की डायनेमिक प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करते हैं । यह विधि कई अन्य सिग्नलिंग मार्ग के विश्लेषण के लिए लागू है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम 2 से 3 एच के एक आवधिक के साथ जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता को नियंत्रित करने के लिए एक विधि से पता चला । इस समय पैमाने पर Tet-On प्रणाली और मूल LightOn प्रणाली सहित अंय पारंपरिक प्रणालियों में लोगों की तुलना में बहुत ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम JST, सफ़ाई (एअर इंडिया), विकास विज्ञान और प्रौद्योगिकी (JPMJCR12W2 (आर.)) के लिए कोर अनुसंधान, अनुदान में सहायता अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान, और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MEXT), जापान द्वारा समर्थित किया गया २६११९७०८ (ai) और 16H06480 (आर. ए.)), वैज्ञानिक अनुसंधान (ए) (विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS) २४२४००४९ (आर.)), और युवा वैज्ञानिकों (ए) (JSPS 15H05326 (एअर इंडिया)), और एक अनुदान में नवाचारी क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता “प्रतिदीप्ति MEXT, जापान के लाइव इमेजिंग “, और MEXT, जापान से रहने वाले सिस्टम के लिए गतिशील दृष्टिकोण के लिए मंच ।
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
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