Summary

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Published: March 22, 2018
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la cellula–cellula trasferimento di informazioni oscillatori di optogenetica controllo e monitoraggio dell’espressione genica live. Questo approccio fornisce una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Abstract

Cellule devono rispondere correttamente a cambiare temporaneamente gli ambienti, che sono influenzati da vari fattori da cellule circostanti. Il via di segnalazione di Notch è uno di tali macchinari molecolari essenziali per le comunicazioni cellula–cellula, che svolge ruoli chiave nello sviluppo normale degli embrioni. Questa via comporta un trasferimento di cellula–cellula di informazioni oscillatorie con Oscillazioni ultradiane, ma nonostante i progressi nelle tecniche di biologia molecolare, è stato impegnativo per delucidare l’impatto delle interazioni multicellulari sul gene oscillatoria dinamica. Qui, presentiamo un protocollo che consente la gestione di optogenetica e monitoraggio in tempo reale di espressione genica in modo temporale preciso. Questo metodo con successo ha rivelato che intracellulari e intercellulari ingressi periodici della tacca di segnalazione entrain oscillazioni intrinseche di frequenza di sintonizzazione e fase spostando la risoluzione di singole cellule. Questo metodo è applicabile per l’analisi delle caratteristiche dinamiche delle varie vie di segnalazione, fornendo una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Introduction

Comunicazione della cellula–cellula giocano un ruolo critico nel patterning embrionale in processi di sviluppo. In embrioni vertebrati, le strutture metamerica chiamate somiti si formano lungo l’asse antero-posteriore corpo con una precisione temporale precisa sotto il controllo di un orologio di tempo di mantenimento, chiamato la segmentazione dell’orologio1. Durante questo processo, un gruppo di cellule del mesoderma presomitic (PSM) periodicamente vengono convertiti in somiti in modo sincrono. Questo processo coinvolge l’espressione genica di oscillatori sincronizzati e cellule PSM che oscillano in fase formano dei metameri stessi. Il periodo dell’espressione genica oscillatorio è circa 2-3 h in topi e a circa 30 min in zebrafish. Quando dissociate, PSM cellule perdono la sincronia2,3, ma quando sono ri-aggregati, possono auto-organizzarsi e recuperare la popolazione sincronia4, suggerendo che l’accoppiamento cellula-cellula è una chiave per il sincronizzato oscillazioni.

Gli sforzi profusi hanno rivelato che le molecole di segnalazione nella via del Delta-Notch strettamente collegate alle oscillazioni sincronizzate dei geni orologio segmentazione. O inibitori farmacologici o mutazioni genetiche della tacca di segnalazione desincronizzarsi la popolazione degli oscillatori. In zebrafish, mutanti della tacca di segnalazione componenti, quali DeltaC, DeltaD e Notch1a, visualizzano asincrona oscillazioni5,6. Negli embrioni di pulcino o il mouse, non solo il ligando Notch Delta-like1 (Dll1), ma anche il tacca modulatore Lunatic fringe (Lfng) è richiesto per oscillazioni sincronizzata7,8,9. Tuttavia, è stato difficile testare la funzionalità di tali molecole per il trasferimento di informazioni dinamiche da cella a cella, perché risoluzioni temporali di perturbazione convenzionale della dinamica di regolazione genica non erano sufficienti per indagare il processi di tempistiche di 2 – 3 h (ultradiane).

Recentemente abbiamo sviluppato un metodo integrato per controllare e monitorare pattern di espressione genica in cellule di mammifero10. Questa tecnologia consente ad induzione di impulsi di espressione genica di illuminazione a luce periodici su scale di tempo ultradiane. Questo protocollo rappresenta i metodi per stabilire linee di cellule fotosensibili e osservare le risposte dinamiche delle cellule reporter di luminescenza di cellule vive di monitoraggio nei contesti delle comunicazioni cellula–cellula. Questo metodo è applicabile per l’analisi di molte altre vie di segnalazione.

Protocol

1. generazione di linee cellulari stabili dal sistema Tol2 Transfect vettori plasmidici (Figura 1A) di moduli basati su Tol2 optogenetica insieme con il vettore di espressione transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) in cellule C2C12. In tutte le fasi, le cellule di cultura con medium DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina-streptomicina a 37 ° C (tabella 1), in presenza di 5% CO2, altrimenti indicato. Contare tripsinizzat…

Representative Results

Abbiamo adattato il LightOn sistema11,12, che consente l’espressione genica di foto-indotta in cellule di mammifero, allo studio della genetiche oscillatori con periodicità di 2 – 3 h. Questo sistema è composto da due parti: il hGAVPO foto-inducible attivatore trascrizionale e una cassetta di UAS-promotore alla trascrizione di unità di arbitrari geni di interesse. Per accelerare la cinetica pulsatile di espressione genica indot…

Discussion

Abbiamo mostrato un metodo per controllare le dinamiche di espressione genica con una periodicità di h 2 o 3. Questa scala temporale è molto più breve rispetto a quelle di altri sistemi convenzionali, tra cui il sistema Tet-On e il sistema LightOn originale. Parametri chiave per raggiungere le scale temporali ultradiane sono emivite di prodotti molecolari indotti da foto, mRNA e proteine. Questi parametri cinetici possono dipendere di specie e tipi di cellule. Per la sintonizzazione la cinetica, sostituendo sequenze H…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da JST, PRESTO (A.I.), Core ricerca evolutiva di scienza e tecnologia (JPMJCR12W2 (R.K.)), sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT), Giappone 26119708 (A.I.) e 16 H 06480 (R.K.)), scientifico (A) (Giappone società per la promozione della scienza (JSPS) 24240049 (R.K.)), di ricerca e giovani ricercatori (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)) e una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi “fluorescenza Live imaging”del MEXT, Giappone e piattaforma per approcci dinamici a Living System da MEXT, Giappone.

Materials

FACS Becton, Dickinson and Company FACSAriaII SORP
Camera Andor iKon M-934
Microscope Olympus IX-81 ZDC
PMT device Churitsu eletric corp. CL24B-LIC/B
Blue LED illuminator OptoCode LEDB-SBOXH
DMEM Nacalai 08459-35 
Penicillin-streptomycin Nacalai 26253-84
Fetal bovine serum Sigma 172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate ) Hi-tech 303012
D-Luciferin Potassium Salt Nacalai 20028-24 
Light meter LI-COR Biosciences LI-250A
anti-HA-Peroxidase antibody Roche clone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibody Wako clone 2F3

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Cite This Article
Isomura, A., Kageyama, R. An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions. J. Vis. Exp. (133), e57149, doi:10.3791/57149 (2018).

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