Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen
Summary
De nauwkeurige identificatie van satelliet cellen is essentieel voor de studie van hun functies onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit artikel presenteert een protocol ter identificatie van de satelliet cellen op volwassen skeletspieren secties door immunofluorescentie gebaseerde kleuring.
Abstract
Immunofluorescentie is een effectieve methode die helpt bij het identificeren van verschillende celtypes op weefselsecties. Om de gewenste celpopulatie te bestuderen, worden antilichamen tegen specifieke cel markeringen op weefselsecties toegepast. In volwassen skeletspieren zijn satelliet cellen (gcv) de cellen van de stam die aan spier reparatie en regeneratie bijdragen. Daarom is het belangrijk om te visualiseren en traceren van de satelliet-celpopulatie onder verschillende fysiologische omstandigheden. Rusten skeletspieren, SCs zich bevinden tussen de basale lamina en myofiber plasmamembraan. Een veelgebruikte marker voor het identificeren van SCs op de myofibers of in de cultuur van de cel is de gekoppelde vak eiwit Pax7. In dit artikel wordt een geoptimaliseerde Pax7 immunofluorescentie protocol betreffende skeletspieren secties gepresenteerd die aspecifieke kleuring en achtergrond minimaliseert. Een ander antilichaam dat een proteïne (laminin) van de basale lamina herkent is ook toegevoegd om te helpen bij het identificeren van SCs. vergelijkbaar protocollen kunnen ook worden gebruikt voor het uitvoeren van dubbele of driedubbele labelen met Pax7 en antilichamen voor extra eiwitten van belang.
Introduction
Skeletspieren is samengesteld uit multinucleaire spiercellen, genaamd myotubes, georganiseerd in de myofibers, die kracht en bewegingen door contractie genereren. Meest skeletspieren, met uitzondering van sommige craniofaciale spieren, zijn afgeleid van een tijdelijke embryonale structuur genaamd een Somiet1. Myogenic voorlopercellen delamineren uit de epitheliale Somiet tot myoblasts. Myoblasts verder onderscheiden in myocytes die samensmelten tot myotubes multi genucleëerde myofibers vormen. Het hierboven beschreven proces heet myogenesis en wordt gekenmerkt door stoffelijk-gereglementeerde controle op de genexpressie. Myogenic precursoren express Pax3 en Pax7, terwijl myoblasts express MyoD en/of Myf5 en myocytes express myogenin en myosins2,3. Spiergroei is een proces waarin myofibers groter worden door meer myonuclei op te nemen in bestaande vezels (hyperplasie) en door een toename van de spiervezel grootte (hypertrofie)4. Tijdens de spiergroei is er een duurzame bron van myogenic cellen, die cel van de stam eigenschappen hebben dat ze kunnen onderscheiden en zelf vernieuwen. Deze cellen zijn cellen van de satelliet op basis van hun fysieke locatie tussen het sarcolemma (celmembraan van de myofiber) en de basale lamina5genoemd. SCs krachtig bijdragen aan spiergroei in de juveniele fase (de eerste 2-3 weken van de postnatale muizen), maar geven in rust volwassen spier6geworden. Opmerkelijk is, kunnen zij zitten re-geactiveerd in reactie op spier verwondingen en differentiëren in nieuwe spiercellen te herstellen van de beschadigde spier7.
De cel van de stam-eigenschappen maken de studie van SCs relevant zijn voor zowel de fundamentele spier biologie en de therapieën van spier ziekten8. Dientengevolge, kan het een gebied van intens onderzoek in de afgelopen decennia is geweest. Een enorme vooruitgang is geboekt in de ontrafeling van de genetica en de epigenetica van SCs9,10. Die betrokken zijn bij het opsporen en identificeren van SCs in situ technieken werden ontwikkeld en geoptimaliseerd langs de manier11. Immunefluorescentie kleuring kan de identificatie van SCs door het gebruik van specifieke antilichamen, met inbegrip van die voor Pax7. Echter, de schaarste en de kleine grootte van de SCs gecombineerd met een sterke auto-fluorescentie van volwassen skelet spierweefsel maken de visualisatie uitdagend. Hier beschrijven we een immunefluorescentie kleuring protocol geoptimaliseerd voor muis spierweefsel voor Pax7 en op basis van een bestaande methode voor zebrafish spier12. Bovendien is een Laminin antilichaam gemarkeerd met een aparte fluorophore aangewend om te identificeren van de basale lamina waaronder de SCs zich bevinden. Dit protocol maakt consequent de visualisatie van Pax7-positieve SCs en myogenic precursoren onder alle geteste fysiologische omstandigheden en ontwikkelingsstadia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bovenstaande protocol was gebaseerd op een methode van Pax7/MF20 kleuring op zebrafish skeletspieren12. De oplossingen gebruikt en het blokkeren van stappen zijn identiek of soortgelijk. De antilichamen die gebruikt zijn identiek. De aangepaste stappen waren gebaseerd op de kenmerken van de muis spierweefsel en SCs. Eerst, Laminin antilichaam werd toegevoegd in de mix om te helpen bij het visualiseren en bevestigen van de positie van SCs. Het was bijzonder nuttig om te tellen van het aantal SC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de NIAMS licht Imaging sectie voor het verstrekken van de microscopen en technische hulp. De MF20 en Pax7 antilichamen zijn verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank onder auspiciën van de NICHD ontwikkeld en onderhouden door de afdeling biologische wetenschappen, de Universiteit van Iowa, Iowa City. Dit werk werd gesteund door de intramurale onderzoek programma van NIAMS van de National Institutes of Health.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
References
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy – Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
